标题：《动脉粥样硬化》 内容： 第一章　脂质化学及其代谢第一节　脂质种类及化学结构（缺）第二节　脂质代谢一、脂肪酸代谢（一）脂肪酸（fattycaid）的分解代谢-脂肪动员动物将脂肪酸以甘油三酯的形式贮存在脂肪组织内。 一旦机体需要时，脂肪酶即可逐步水解甘油三酯为游离脂肪酸（freefat acid, FFA）及甘油并释放入血以供其他组织氧化利用，这一过程称为脂肪动员。 调节这一过程的关键酶为激素敏感性甘油三酯脂肪酶。 当禁食、饥饿或交感神经兴奋时，肾上腺素、去甲肾上腺素、胰高血糖素等分泌增加，作用于脂肪细胞膜表面受体，激活腺苷酸环化酶，促进cAMP合成，激活cAMP-蛋白激酶，使胞液内甘油三酯脂及的调控敏感，故称为激素敏感性脂肪酶。 脂肪分解成游离脂肪酸和甘油后进入血。 血浆白蛋白具有结合游离脂肪酸的能力，脂肪酸不溶于水，与白蛋白结合后由血流运送至全身各组织，主要由心、肝、骨骼肌等摄取利用。 甘油溶于水，直接由血液运送至肝、肾、肠等组织。 在肝甘油激酶（glycerokinase）作用下，转变为α-磷酸甘油，然后脱氢生成磷酸二羟丙酮，循糖代谢径而代谢。 （二）脂肪酸的β-氧化脂肪酸是人及哺乳动物的主要能源物质。 供能方式是通过β-氧化，在O2供给充足的条件下，脂肪酸在体内被分解成CO2和H2O并释放出大量能量以ATP形式供机体利用。 除脑组织外，大多数组织均能氧化脂肪酸，但以肝和肌肉最为活跃。 脂肪酸氧化的亚细胞器是线粒体，而脂肪酸是不能自由通过其内膜的。 因此脂肪酸在进入线粒体之前必然被活化和转载。 1．脂肪酸的活化-脂酰CoA的生成。 在ATP、CoASH、Mg2+存在下，脂酰CoA合成酶（acyl-CoAsynthetase）催化脂肪酸活化，生成脂酰CoA。 2. 脂酰CoA进入线粒体在线粒体内膜两侧有肉毒碱脂酰转移酶(carnitine acyltransferase)Ⅰ和Ⅱ,该酶促进脂酰CoA将脂酰基转移到肉毒碱生成脂酰肉毒碱. 后者与载体结合进入线粒体内侧,在内侧由肉毒碱脂酰转移酶Ⅱ催化脂酰肉毒碱转变为脂酰CoA并释放肉毒碱。 3．脂肪酸的β-氧化在线粒体基质中疏松结合的脂肪酸β-氧化多酶复合体的催化下，从酯酰基的β-碳原子开始进行脱氢，加水，再脱氢及硫解等四步连续反应，脂酰基断裂生成-分子比原来少两个碳原子的脂酰CoA和-分子乙酰CoA。 4．脂肪酸氧化的能量生成体内能量的重要来源之一是脂肪酸的氧化。 以软脂酸为例，进行7次β-氧化，生成7分子FADH2，7分子NADH+H+及8分子酰CoA。 每分子FADH2通过呼吸链氧化产生2分子ATP，每分子ANDH+H+氧化产生3分子ATP，每分子乙酰CoA通过三羧酸循环氧化产生12分子ATP。 因此一分子软脂肪酸彻底氧化共生成（7×2）+（7×3）+（8×12）=131ATP。 减去脂酸活化时耗去的2个高能磷酸键，相当于2个，ATP净生成129分子ATP或129×30. 5=3935KJ/mol。 软脂酸在体外彻底氧化成CO2及H2O时的自由能为971KJ。 故其能量利用率为：3935/9791×100%=40%5．脂肪酸的其他氧化方式除β-氧化之外，机体还存在脂肪酸氧化的其他方式：①不饱和脂肪酸的氧化。 不饱和脂肪酸也在线粒体中进行β-氧化，所不同的是饱和脂肪素β-氧化过程中产生的脂肪烯酰CoA是反式△2脂烯酰CoA，而天然不饱和脂肪酸中的双键均为顺式。 因此，需经线粒体特异的△3顺→△2反脂烯酰CoA异构酶的催化，将△3顺式转变为β-氧化酶系所需的△2反式构型，然后沿β-氧化途径进行代谢。 ②过氧化酶体脂肪酸氧化，除线粒体外，过氧化酶体中亦存在脂肪酸β-氧化酶系，它能使极长链脂肪酸氧化成较短链脂肪酸，而对较短链脂肪酸无效；在脂肪酸氧化酶（FAD为辅基）催化下，脱下的氢不与呼吸链偶联产生ATP而是生成H2O2，后者为过氧化氢酶分解；③丙酸的氧化，人体含有极少量奇数碳原子脂肪酸，β-氧化后除生成乙酰CoA外，最终生成丙酰CoA。 另外，支链氨基酸氧化亦可产生丙酰CoA。 丙酰CoA经β-羧化及异构酶的作用可转变为琥珀酰CoA，然后参加三羧酸循环而被氧化。 6．酮体的生成及利用酮体是乙酰乙酸（acetoacetate），β-羟丁酸（β-hydroxybatyrate）及丙酮（acetone）三者的统称。 酮体是脂肪酸在肝分解氧化时特有的中间代谢物，因为只有肝具有合成酮体的酶系，但缺乏利用酮体的酶系。 酮体的利用，除肝外，肝外心、肾、脑及骨骼肌线粒体是较高活性的利用酶。 其一是琥珀酰CoA转硫酶，催化乙酸转变为乙酰乙酰CoA，其二是乙酰乙酰CoA硫解酶催化乙酰乙酰CoA生成乙酰CoA，后者即可进入三羧酸循环而被氧化供能。 其三是乙酰乙酸硫激酶，此酶可直接活化乙酰乙酸生成乙酰乙酰CoA，后者在硫解酶的作用下硫解为2分子乙酰CoA。 另外，β-羟基丁酸在β-羟丁酸脱氢酶的催化下，脱氢生成乙酰乙酸，然后循上述途径代谢。 而丙酮不能按上述方式活化，除随尿排出外，在血中酮体剧烈升高时，可从肺直接呼出，总之，肝是生成酮体的器官，但不能利用酮体，而肝外组织不能生成酮体，却可利用酮体。 （三）脂肪酸的合成代谢长链脂肪酸以乙酰CoA为原料在胞液内由不同于β-氧化的脂肪酸合成酶及多功能酶等催化而完成。 1．脂肪酸合成酶系及反应过程在乙酸CoA羟化酶的作用下，乙酰CoA羧化成丙二酸单酰CoA。 ATP+HCO3-+乙酰CoA→丙二酰CoA+ADP+Pi在多酶体系或多功能酶的作用下，乙酰CoA与丙乙酰开始重复加成过程，每次延长二个碳原子。 十六碳软酯酸的生成，需经过连续的七步重复加成。 脂肪酸生物合成，从乙酰CoA合成丁酰-S-ACP为第一轮反应，七步反应分别有七种酶催化。 ①乙酰CoA羧化酶；②乙酰基-ACP转移酶；③丙二酸单酰基-ACP转移酶；④3-酮酰基-合成酶；⑤3-酮酰基-ACP还原酶；⑥3-羧酰基-ACP脱水酶；⑦3-烯酰基-ACP还原酶。 七种酶催化完成七步反应最后生成丁酰-SACP。 需指出的是在大肠杆菌中七种酶蛋白聚合在一起构成多酶体系，而高等动物，这七种酶活性都在一条多肽链上，属多功能酶。 脂肪酸生物合成的碳链延伸循环过程是每轮新生成的酰基-SACP再与丙二酸单酰-SACP缩合，经还原、脱水和还原诸反应延伸两个碳原子，这样每轮循环，加上两个碳原子。 所以软脂酸经七次循环即生成。 2，不饱和脂肪酸的合成人体所含的不饱和脂肪酸主要有软油酸、油酸、亚油酸、亚麻酸及花生四烯酸等。 前两种可由人体自身合成，而后三种则必须从食物摄取，因为人体缺乏相应的去饱和酶。 去饱和酶位于动物体内组织内质网上，其催化脱氢过程已基本明了。 此氧化脱氢过程有线粒体外电子传递系统参与。 该系统在有机毒物氧化或苯环上加氧等机体解毒过程中，也有重要作用。 例如去饱和酶能使硬脂酸（18：0）脱去2H成油酸（18：1，△9）。 3．脂肪酸合成的调节脂肪酸合成主要受二方面的调节：一是代谢物的调节作用。 进食高脂肪食物以后或饥饿会使脂肪动员加强，肝细胞内脂酰CoA增多，可别构抑制乙酰CoA羧化酶，从而抑制体内脂肪酸的合成；进食糖类使糖代谢加强。 NADPH及乙酰CoA供应增多，有利于脂肪酸的合成，同时糖代谢加强使细胞内ATP增多，可抑制异柠檬酸脱氢酶，造成异柠檬酸及柠檬酸堆积，透出线粒体，可别构激活乙酰CoA羧化酶，使脂肪酸合成增加，此外，大量进食糖类也能增加各种合成脂肪有关的酶活性从而使脂肪合成增强；二是激素的调节作用。 胰岛素是调节脂肪合成的主要激素，它能诱导乙酶羟化酶，脂肪酸合成酶乃至ATP-柠檬酸裂解酶等的合成，从而促进脂肪酸合成。 胰岛素还能促进脂肪酸合成磷脂酸。 胰高血糖素，肾上腺素、生长素则与胰岛素作用相反，通过抑制乙酰CoA羧化酶的活性，从而阻止脂肪酸的合成。 二、多不饱和脂肪酸的重要衍生物-前列腺素、血栓烷及白三烯前列腺素（prostglandins,PG）最早发现于精液，现知前列激腺素来源广泛，种类繁多，但均为二十碳多不饱和脂肪酸的衍生物。 血栓烷（thromboxane,TX）来自白细胞，是由二十碳多不饱和脂肪酸的衍生物，来自血小板。 白三烯（leukotrienes，LT）来自白细胞，是由二十碳多不饱和和脂肪酸衍生而来。 PG、TXA2及LT3几乎参予了所有细胞代谢活动，并且与炎症、免疫、过敏、心血管病等重要病理过程有关，在调节细胞代谢上亦具有重要作用。 （一）前列腺素（PG）、血栓烷（TX）及白三烯（LT）的合成1．PG及TX的合成。 以花生四烯酸为原料，机体除红细胞外，其他各组织均有合成PG的酶系。 血小板内还有血栓烷合成酶。 当细胞受外界剌激如血管紧张素Ⅱ（agniotensionⅡ）、缓激肽（bradydinin）、肾上腺素、凝血酶及某些抗原抗体复合物或一些病理因子（许多激活因素尚未清楚），细胞膜中磷脂酶被激活，使磷脂水解释出花生四烯酸，在一系列的作用下，逐步合成PG和TX，其合成过程如图1-1所示。 图1-1 PG和TX合成示意图2．白三烯的合成白三烯合成同样以花生四烯酸为原料，在脂氧合酶（lipoxygenase）作用下，生成氢过氧化二十四烯酸（5-HPETE），后者在脱水酶作用下生成白三烯（LTA4）。 LTA4在酶促作用下转变成具有重要生物活性的化合物，如LTB4、LTC4、LTD4、及LTE4等。 如图1-2所示。 （二）血栓烷（TX），内过氧化物与环前列腺素（PGI2）这两种物质是与前列腺素有密切联系的化合物。 血栓烷A2（TXA2）由血小板内血栓烷合成酶催化合成。 由于是首先在血小板内分离出而且分子内含有一个血栓烷，故名。 血栓烷B2（TXB2）和6-酮基前列腺素F1a是TXA2和PGI2的降解产物，无生物活性。 环前列腺素（PGI2）含有二个五碳环。 故名，它是在人类动脉及静脉最里面的内衬处合成（包括冠状动脉内衬），由环前列腺素合成酶催化。 图1-2 白三烯合成示意图三、胆固醇代谢（一）胆固醇（clolesterol）的消化吸收胆固醇主要由机体自身合成，但亦从食物中少量摄取。 胆固醇主要来自动物内脏、蛋黄、奶油、肉等动物性食品，植物性食品不含胆固醇，但含植物固醇，过多摄入植物固醇可抑制胆固醇的吸收。 食物中胆固醇以游离胆固醇和胆固醇酯两种形式存在，其中游离胆固醇占总量的85%～90%。 胆固醇酯经胆汁酸盐乳化后，在小肠中为胰胆固醇酯酶水解生成游离胆固醇。 游离胆固醇与胆汁酸盐，磷脂及脂肪的水解产物甘油一酯、脂酸等结合成混合微团，为小肠粘膜吸收。 吸收的游离胆固醇80%～90%在肠粘膜细胞内，又与长链脂酸（主要是油酸）结合成胆固醇酯，后者大部分参入乳糜微粒（chylomicrons,CM），少量参与组成极低密度脂蛋白（verylowdensitylipoprotein, VLDL）经淋巴进入血循环。 未被吸收的胆固醇在小肠下段及结肠被细菌还原转化为类固醇随粪便排出。 胆固醇的消化吸收可以由以下因素影响：①胆汁酸盐，它促进脂类包括胆固醇及固醇酯的乳化，既有利于胰脂酶及胆固醇酯酶及胆固醇酯酶的作用，又有利于胆固醇的吸收；②食物脂肪，脂肪能促进胆汁分泌，其分解产物又是混合微团的重要成份，它还促进肠粘膜细胞合成乳糜微粒，故食物脂肪有利于胆固醇的吸收；③植物固醇，由于其结构与胆固醇相似，但不易吸收，摄入过多可抑制胆固醇的吸收；④纤维素、果酸可与胆汁酯盐结合而促进其粪便排出，间接减少胆固醇的吸收；⑤某些药物如消胆胺，系阴离子交换树脂，它可与胆汁酸盐结合，加速胆汁酸盐的排泄，间接减少胆固醇的吸收。 （二）胆固醇的合成1．合成部位胆固醇合成部位除成年动物脑组织及成熟红细胞外，几乎在全身各组织内都可合成。 但肝是主要合成场所，占合成总量的70%～80%。 胆固醇合成酶系存在于胞液及光面内质网膜上，因此胆固醇的合成主要在胞液及内质网中进行。 2．合成过程胆固醇合成部位以乙酰CoA为原料，而乙酰CoA主要产生于线粒体内，它不能自由通过线粒体内膜，需在线粒体内先与草酰乙酸缩合成柠檬酸，后者再通过线粒体内膜的载体进入胞液，然后在柠檬酸裂解酶的作用下，裂解生成乙酰CoA。 这一过程是耗能的，每转支1分子乙酰CoA，要耗去1分子ATP。 由乙酰CoA合成胆固醇需要大量的NADPH+H+及ATP供给合成反应所需的氢和能量。 每合成1分子胆固醇需18分子乙酰CoA，36分子ATP及16分子NADPH+H+。 乙酰CoA及ATP大多来自线粒体中糖的有氧氢化，而NADPH则主要来自胞液中糖的磷酸戊糖代谢途径。 胆固醇合成步骤十分复杂，有近30步酶促反应大致可划分为三个阶段：（1）甲羟戊酸的合成。 在乙酰乙酰硫解酶的催化下，二分子乙酰CoA缩合成乙酰乙酰CoA；然后在羟甲基戊二酸单酰CoA合成酶（3-hydroxy-3-methylglutarylCoASynthase,HMG CoA Synthase）的催化下再与一分子乙酰CoA缩合生成痉甲基戊二酸单酰CoA（3-hydroxy-3methylglutarylCoA,HMGCoA）。 HMGCoA是合成胆固醇及酮体的重要中间产物。 在线粒体中，三分子乙酰CoA缩合成的HMGCoA裂解后生成酮体；而在胞液中生成的HMGCoA则在内质网HMGCoA还原酶（HMGCoA reductase ）的催化下，由NADPH+H+供氢，还原生成甲痉戊酸（mevalonicacid,MVA）。 HMG CoA还原酶是合成胆固醇的限速酶，该步也是胆固醇合成的限速反应。 (2)鲨烯的合成。 MVA（C6）由ATP提供能量，在胞液内一系列酶的催化下，脱羧、磷酸化生成活泼的异戊烯焦磷酸（△3-isopenterylpyrophosphate, IPP）和二甲基丙烯焦磷酸（3,3-dimetytlallypyrophosphate ,DPP）然后三分子活泼的5C焦磷酸化合物（IPP及DPP）缩合成15C的焦磷酸法呢酯(farnesylpyrophosfhate, EPP)。 二分子15C焦磷酸法呢酯在内质网鲨烯合酶(squalenesynthase)的作用下，再缩合，还原即生成30C的多烯烃-鲨烯(squalene)。 图1-3 胆固醇合成代谢图（3）胆固醇的合成。 鲨烯为含30个碳原子的多烯烃，具有与固醇母相近似的结构。 鲨烯结合在胞液中固醇载体蛋白（sterolcarrierprotein,SCP）上以内质网单加氧酶和环化酶等的作用，环化生成羊毛固醇，后者再烃经氧化，脱羧，还原等反应，脱云个甲基（次CO2形式后成27℃的胆固醇，如图1-3所示。 3. 合成调节对胆固醇合成的调节主要是通过对HMGCoA还原酶活性的影响来实现的。 （１）饥饿与饱食。 饥饿与禁食可抑制肝合成胆固醇。 禁食使HMGCoA还原酶合成减少活性降低外，乙酰CoA，ATP，NADPH+H+的不足也是胆固醇合成减少的重要原因。 相反摄取高糖、高饱和脂肪膳食后，肝HMGCoA还原酶活性增加，胆固醇的合成增加。 （2）胆固醇。 它可反馈抑制肝胆固醇合成，主要是HMGCoA还原酶的合成。 如图1-3所示。 （3）激素。 胰岛素及甲状腺素能诱导肝HMGCoA还原酶的合成，从而加速胆固醇的合成。 胰高血糖素及皮质醇则能抑制则能抑制并降低HMGCoA还原酶的活性，因而减少胆固醇的合成。 甲状腺素除能促进HMGCoA还原酶的合成外，同时又促进胆固醇在肝转变为胆汁酸，且后一作用较前者强，结果使血清胆固醇含量反而下降。 另外，胆固醇合成有明显的昼夜节律性。 午夜时合成最高，而中午合成最低，主要是肝HMGCoA还原酶活性有昼夜节律性所致。 （三）胆固醇的转化1．在肝内转化成肝汁酸正常人每天约合成1. 0-1. 5g胆固醇，其中约2/5（0. 4-0. 6g）在肝内转变成胆汁酸，随胆汁排入肠道。 胆固醇在肝实质细胞的内质网7α羟化酶作用下，由NADPH+H+供氢，O2参加，7α-羟化生成7α-羟胆固醇。 7α-羟化酶属单加氧酶系，是胆汁酸合成的限速酶。 7α-羟胆固醇在内质网3α-及12α-羟化酶的作用下，亦需NADPH+H+及O2参加，3α-及12α-羟化，然后17β侧链经β-氧化脱去丙酰CoA即形成24C的胆酸。 仅3α和7α-羟则生成鹅脱氧胆酸。 二者再在肝细胞酶的催化下，分别与甘氨酸及牛磺酸结合即形成结合型的甘氨胆酸，牛磺胆酸，甘氨鹅脱氧胆酸及牛磺鹅脱氧胆酸。 结合型的胆汁酸分泌入毛细胆管经胆管随胆汁排入胆囊储存或排入肠道。 胆汁酸可反馈抑制7α-羟化酶从而抑制胆汁酸的合成。 结合型的初级胆汁酸随胆汁分泌入肠道后，在小肠下段及大肠中受细菌的作用，发生水解，生成游离型的胆汁酸随胆汁分泌入肠道细菌作用下，使7α羟基脱氧，胆酸转变为7-脱氧胆酸（7-deoxycholic acid）鹅脱氧胆酸转变为石胆酸（ lithocholic acid）。 在肠道细菌作用后生成的7-脱氧胆酸及石胆酸即次级胆汁酸。 胆汁酸排入肠腔后，大部分未经细菌作用的结合型胆汁酸（甘氨胆酸及牛磺胆酸）在小肠，主要是回肠，通过主动吸收经门静脉回到肝，经肠道细胞作用后的游离型次级胆汁酸在大肠通过被动扩散进入门静脉。 然后进入肝。 肝细胞将从肠道来的游离型次级胆汁酸转变为结合型初级胆汁酸，与新合成的结合型胆汁酸一起，再分泌入毛细血管，经胆道又排入肠腔，这一过程称为肠肝循环。 每次由肝排入肠腔的胆汁酸95%以上均被重吸收再利用，仅小部分随粪便排出。 胆汁酸生理作用是促进脂类的消化吸收。 由于胆汁酸分子具有亲水和疏水的两个侧面，是一种很好的乳化剂，能使疏水的酯类在水中乳化成细小的微团，既有利于消化酶的作用，又促进其吸收。 另外，还可阻止胆固醇在胆汁中形成结石（沉淀）。 胆固醇难溶于水，胆汁在胆囊中浓缩后胆固醇较易析出沉淀。 而胆汁酸盐卵磷酯，可使胆固醇分散形成成可溶性微团，使之不易形成结晶。 若胆汁中胆固醇浓度过高或胆汁中酸盐及卵类脂与胆固醇的比值降低（小于10：1），则胆固醇析出沉淀，引起结石。 2．胆固醇在肝外组织的转化胆固醇是肾上腺皮质、睾丸、卵巢等内分泌腺合成类固醇激素的原料。 合成类固醇激素是胆固醇在体内代谢的重要途径。 （1）肾上腺皮质激素的合成。 肾上腺皮质的球状带、束状带及网状带分别能够合成醛固酮、皮质醇（酮）、性激素。 胆固醇是合成这些激素的原料。 胆固醇在皮质细胞线粒体内膜的20α-羟化酶，22β-羟化酶及20，22碳链裂解酶的作用下，断裂侧链、释出一分子异已醛（6C），生成21碳的孕烯醇酮，羟化反应需NADPH+H+及O2参加。 然后孕烯醇酮输出线粒体，在内质网异构酶的催化下，脱氢异构化生成21的碳的孕酮。 孕酮是合成皮质激素的重要中间物，本身也具有激素活性，孕酮在17α、21β、11β及18羟化后，即可合成不同的皮质激素。 （2）睾丸酮的合成。 睾丸间质细胞可直接以血胆固醇为原料合成睾丸酮。 在17α-羟化酶及17，20碳裂解酸的作用下，胆固醇转化睾丸酮。 （3）雌性激素的合成。 睾丸酮是卵巢合成雌二醇的直接前体。 卵巢独有19-羟化酶，19-氧化酶及10,19碳裂解酶,在NADPH+H+及O2的参加下,睾丸酮的19位甲基氧化,三环芳香化转变为苯环,形成雌二醇。 雌二醇的生理活性最大，雌酮（estrone）及雌三醇（estriol）为其代谢产物。 图1-4 胆固醇的主要代谢途径胆固醇代谢与其他脂质代谢密切相关，是脂蛋白代谢的一个组成部分。 血清胆固醇水平高低反映了机体某些脏器的代谢障碍，如血清胆固醇升高的有关疾病有：①糖尿病（LDL）代谢异常等；②甲状腺机能降低（胆固醇转换成胆汁酸盐减少）；③胆汁淤滞症（排泄减少）；④家族性高胆固醇血症（LDL受体缺乏）；⑤肾病综合征（胆固醇合成亢进）。 血清胆固醇降低的有关疾病有：①甲状腺机能亢进症（转变成胆汁酸盐亢进）；②重病肝病（肝产生VLDL和HDL减少）；③吸收不良综合征；④营养失调；⑤无或低β脂蛋白血症（LDL减少）。 如图1-4所示。 四、脂肪、磷脂、糖脂代谢（一）脂肪代谢脂肪的消化和吸收。 膳食中的脂质主要为脂肪，此外还含少量磷脂，胆固醇等。 在小肠经胆汁酸盐有作用，乳化并分散成细小的微团后，再被消化酶消化。 小肠含有胰腺分泌的胰脂酶（pancreaticlipase,PL），磷脂酶A2（phospholipaseA,PLA2），胆固醇酯酶（cholesterylesterase）及辅脂酶（colipase）。 胰脂酶特异催化甘油三酯的1及3位酯键水解，生成2-甘油一酯（2-monoglyceride,MG）及二分子脂肪酸。 胰脂酶必须吸附在乳化脂肪微团水油界面上，才能作用于微团内的甘油三酯。 辅脂酶能于胆汁酸盐及胰脂酶结合并促进胰脂酶吸附在微团的水油界面上，因而能增加胰脂酶的活性，促进脂肪的水解。 磷脂酶A2催化磷脂2位酯键水解，生成脂肪酸及溶血磷脂。 胆固醇酯酶促进胆固醇酯水解成游离胆固醇及脂肪酸。 脂类消化产物主要在十二指肠下段空肠上段吸收。 中链脂肪酸（6-10C）及短链脂肪酸（2C-4C）构成甘油三酯，经胆汁酸盐乳化后即可被吸收，在肠粘膜细胞内脂肪酶的作用下，水解为脂肪酸及甘油，通过门静脉进入血循环。 长链脂肪酸（12-26C）及2-甘油一酯吸收入肠粘膜后，在光面内质网转酰酶（acylstransferase）的催化下，由ATP供给能量，2-甘油一酯加上2分子脂酰CoA，再合成甘油三酯。 后者参入乳糜微粒的组成，经淋巴进入血循环。 （二）脂肪的合成脂肪（酰基甘油三酯）是机体储存能量的形式。 肝、脂肪组织及小肠是合成甘油三酯的主要场所，以肝的合成能力最强。 甘油三酯合成原料是由葡萄糖代谢提供的甘油及脂肪酸。 甘油三酯合成的两条途径，一是小肠粘膜细胞内由消化吸收的甘油一酯及脂肪酸在转酰酶的催化下合成甘油三酯。 二是在肝细胞及脂肪细胞进行的合成途径-甘油二酯途径。 3-磷酸甘油在转酰酶的作用下，加上2分子脂酰CoA生成磷脂酸（phosphatidicacid）。 后者在磷脂酸磷酸酶的作用下，水解脱去磷酸生成1，2-甘油二酯，然后在转酰酶的催化下，再加上1分子脂酰基即生成甘油三酯。 合成脂肪的三分子酸可为同一种脂肪酸，也可是三种不同的脂肪酸。 合成所需的3-磷酸甘油主要由糖代谢提供。 肝、肾等组织含有甘油激酶，能利用游离甘油，使之磷酸化生成3-磷酸甘油。 脂肪细胞缺乏甘油激酶因而不能利用甘油合成脂肪。 （三）磷脂的代谢1．甘油磷脂的合成和降解甘油磷脂可在全身各组织细胞内质网合成，内质网含有合成磷脂的酶系。 但以肝、肾及肠等组织最活跃，其合成原料是脂肪酸，甘油主要由葡萄糖代谢转化而来，但多不饱和脂肪酸必须从植物油摄取，其他原料如磷酸盐、胆碱（choline）、丝氨酸、肌醇（inositol）等可来自食物和体内合成。 其合成过程有两种，一是甘油二酯合成途径。 磷脂酰胆碱及磷脂酰及乙醇胺主要通过此途径合成；二是CDP-甘油二酯合成途径。 肌醇磷脂（phosphatidylinositol）、丝氨酸磷脂（phosphatidyline serine）及心磷脂（cardiolipin）由此途径合成，具体过程如下。 以上是磷脂合成的基本过程。 此外磷脂酰胆碱亦可由磷脂酰乙醇胺从S-腺苷蛋氨酸获得甲基生成。 磷脂酰丝氨酸可由磷脂酰乙醇胺羟化或其乙醇胺与丝氨酸交换生成。 甘油磷脂的合成是在内质网膜外侧面进行，而在胞液中存在一类能促进磷脂在细胞内膜之间进行交换的蛋白质-磷脂交换蛋白（phospholipidexchange proteins）。 不同的磷脂交换蛋白催化不同种类磷脂在膜之间进行交换。 合成的磷脂通过这类蛋白的作用转移至不同的细胞器膜上，从而更新其磷脂。 甘油磷脂的降解是由多种磷脂酶类（phospholipase）分别作用于甘油磷脂分子中的不同酯键。 作用于1，2位酯键的酶分别称为磷脂酶A1和A2，作用于溶血磷脂1位酯键的酶称为磷脂酶B1，作用于3位磷酸酯键的酶称为磷脂酶C，作用磷酸取代基间酯键的酶称为磷脂酶D。 通过以上多种酶的作用甘油磷脂最终分解为甘油、脂肪酸、无机磷酸。 2．鞘磷脂的代谢全身各组织均可合成鞘磷脂，但以脑组织最为活跃。 内质网有合成鞘氨醇酶系，鞘胺醇是各种鞘磷脂的前体物质，其合成过程为：神经鞘磷脂以鞘氨醇为前体，在脂酰转移酶的催化下，其氨基与脂酰CoA进行酰胺缩合，生成N-脂酰鞘氨醇后，者由CDP-胆碱供给磷酸胆碱即生成神经鞘磷脂。 鞘磷脂的降解过程类似于磷脂的降解，在多种磷脂酶的作用下，可逐步水解。 神经鞘磷脂酶存在于脑、肝、脾、肾等细胞的溶酶体中，属于磷脂酶C类，能够使磷酸酯键水解，产生磷酸胆碱及N-脂酰鞘氨醇。 （四）糖酯的代谢1．糖基甘油酯的生物合成糖基甘油酯分子是由糖类、甘油和脂肪酸组成的。 其组成与磷脂的区别只是磷是基团被糖基所取代，因此合成过程与磷脂有许多相似之处。 动物体内合成糖酯最活跃的器官是脑，亚细胞部位是微粒体。 微粒体含有催化生成二半乳糖基甘油二酯的酶系。 2．糖基甘油酯的降解脑组织含有脂肪酶和半乳糖苷酶催化半乳糖基甘油酯的水解反应。 脑微粒体的半乳糖脂酶水解半乳糖基甘油二酯。 动物体只有神经组织含有糖基甘油酯，其浓度在髓鞘形成期开始升高，因为它的合成速度最快，而水解酶活力又相应降低。 由此表明糖脂参与了髓鞘形成的过程。 糖脂降解产物是脂肪酸、半乳糖、甘油。 3．糖鞘脂代谢哺乳动物的糖脂在肝脏和脾脏周转很快，但红细胞发育期动物的脑组织与内膜结合的糖脂半寿期却比较长。 中性糖鞘脂的生物合成是通过在神经酰胺分子上顺序添加单糖而合成寡糖链，催化这一反应的酶总称为糖基转移酶，糖基供体是糖核苷酸衍生物（UDP-半乳糖，UD-P葡萄糖等，单糖从它的核苷酸衍生物转移给适宜的受体（底物）合成各种中性糖鞘脂。 其中已糖苷神经酰胺的合成途径有两条。 其一，是从鞘氨醇和UDP-半乳糖合成鞘氨醇半乳糖苷，由UDP-半乳糖：鞘氨醇β-半乳糖基转移酶催化，再经一个酰基转移酶合成1-0-半乳糖苷神经酰胺。 但是已糖苷神经酰胺还是主要通过第二条途径合成的，即鞘氨醇首先酰化产生神经酰胺，后者再经UDP-半乳糖：N酰基鞘氨醇半乳糖转移酶催化合成1-0-半乳糖神经酰胺。 中性糖鞘脂的合成则是在多种糖基转移酶的催化下逐步合成的。 如半乳糖基转移酶有催化生成α（1→4）糖苷键的酶，也有催化产生β（1→4）或β（1→3）糖苷键的酶；此外还有葡萄糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶β（1→3）和不止一种N-乙酰氨基半乳糖转移酶催化产生β（1→3）糖苷键和催化产生а（1→3）糖苷键。 葡萄糖苷酶、N-乙酰、β-氨基乙糖苷酶、α-岩藻糖苷酶、芳香基硫酸酯酶和神经酰胺酶。 由于糖鞘脂的分子结构复杂，因此每一类酶呈现多样的底物专一性。 糖硝酯被以上诸酶水解生成鞘氨醇、脂肪和酸糖基。 第三节　脂质的生理功能如前所述脂质化学结构各异，因而具有多种生物功能，如贮存能量、组成生物膜；组成细胞表面的特殊物质如受体、识别因子等。 一、贮存能量机体在正常生理条件下，由葡萄糖提供能量，葡萄糖增多首先可转变为糖原储存，继而转变为脂肪（甘油三酯）存入脂肪组织；另外，身体的生长、组织的修复和酶类的合成，要维持充足的蛋白质供应，多余的蛋白质也转变成脂肪贮存起来，当机体需要能量时首先动用糖原，其次才动用脂肪。 二、构成生物膜生物膜结构不仅是细胞结构的组织形式，也是生命活动的主要结构基础。 许多生命过程，如能量转换、物质运输、信息识别与传递、细胞发育和分化，以及神经传导，激素作用等都与生物膜有密切关系。 生物膜（包括细胞表面膜即质膜和各种细胞器膜）是由脂质双分子层与镶嵌或附着在此双分子层内的蛋白质所组成的。 生物膜结构的“流动镶嵌模型”说明脂质双分子层是生物膜的基本结构，磷脂组成了不连续的流动双分子层（此外尚有胆固醇和糖脂等），它作为内嵌膜蛋白的基质。 也给各种不同大小的分子提供进出膜的通透性屏障。 少部分磷脂含有特异性的脂肪酸链或特殊的极性头，能专一地与某些膜蛋白相互作用，从而执行特定的生物功能。 生物膜的结构是相对稳定而又具流动性，其流动性取决于膜脂的脂肪酸组成和胆固醇含量，亦受温度的影响。 在生理条件下生物膜的脂质和蛋白质分子能自由地在膜上进行侧向扩散，但从膜双分子层的一侧向另一侧翻转运动则比较困难。 生物膜的双分子层两侧表面呈现不对称分布。 膜蛋白和膜糖在膜结构内不对称现象是绝对的，而膜脂的不对称现象不是绝对的，几乎各种类型的脂质都存于膜双分子层的两侧，但其含量与分布各异。 脂质分子层作为膜的基本结构，含有品种繁多，化学性质各异的磷脂和少量糖脂。 膜脂有共同的结构特点：它们都是两性分子，具有亲水的极性头和疏水的疏水尾。 这种独特的结构特点使它在水溶液中，能自发地形成胶束或片状双层结构。 由两排脂质分子构成的片状双层结构就是脂质双分子层。 在脂质分子层内所有分子的极性头，都面向膜的两侧水溶相。 在生物膜内磷脂以不对称的方式构成双分子层，这就是膜磷脂的拓扑结构不对称现象。 膜磷脂通过各种膜结构之间相似磷脂分子重新分布进行周转与更新，从而维持磷脂在膜结构中不对称分布，这种磷脂在膜结构间的周转重排过程为磷脂交换，这是完整的磷脂分子交换过程。 这种交换生物体内是相当普通的。 磷脂分子通过交换，侧向扩散等维持自身的更新，修复或取代那些死去的细胞膜结构，保障细胞膜的通透性，控制着体内代谢产物的流失和外源有毒物的潜入，发挥着重要作用。 三、脂质的转化作用通过转化生成相应的具有生物活性的物质，如胆固醇转化为相应的激素，后者在机体生长、发育、代谢发挥着不可取代的作用。 由脂肪酸转化的前列腺素，而前列腺素近年来倍受重视，它对心血管系统的作用表现为增加心肌收缩性，降低动脉血压，同时伴随着血管扩张和增加血管通透性，前列腺素对大脑皮层有镇定和安定效应。 前列腺素还能使支气管哮喘缓解而被用于治疗哮喘。 另外，鞘磷脂、糖鞘酯是神经组织特有的物质，其作用不可忽视。 还有一些维生素，如类萜维生素、维生素A、维生素E、维生素K是生命必需的物质。 并且随着脂质研究的继续，一些重要作用将会被发现。 总之，脂质对于生命的作用是巨大的。 （黄俊军）（脂质化学及其代谢）参考文献1．Drayr JP,Vamecq J. 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John Wiley1-5；分别为ε4/4、ε4/2、ε4/3和3/3；基因型6：PCR产物（292bp）四、ApoE多态性与疾病人群中ApoE多态性存在种族变异，不同人群中ApoE基因型高度不同。 欧洲人ε4等位基因频率从北到南呈下降趋势的分布。 亚洲人ε4频率低，相比之下，非洲人及巴布比亚和新几内亚ε4频率高。 由于早期观察到ApoE2/2表型的Ⅲ型高脂蛋白血症病人未在成年即患冠心病，从此，对ApoE多态性进行了广泛研究，许多证据认为，ApoE多态性是动脉粥样硬化早期及发展过程中个体差异的主要原因。 大量人群调查发现ε4等位基因的一般作用是可以显着地升高健康人的总胆固醇浓度，使之易患动脉粥样硬化，相反，ε2等位基因的一般作用是降低胆固醇浓度，其降低效应是ε4升高胆固醇的2～3倍。 ApoE等位基因变异还与血浆ApoB浓度、甘油三酯及血管收缩压有关。 Menzel等认为ε2等位基因对冠状动脉硬化的发展有防护作用，经临床研究发现，患心血管疾病如心肌梗塞幸存者，或血管造影证明有动脉粥样硬化者，比其对照组的ε4等位基因频率高。 ApoE4/3杂合子比E3/2和E3/3基因型者发生心肌梗塞年龄早。 ApoE多态性变异还与肾病综合症、糖尿病有关。 值得重视的是ApoE多态性与老年性痴呆病（AD）的关系。 1993年，Rose研究发现，晚发性家族型AD病人ε4频率增多，还发现ApoE和来源于淀粉样前体蛋白的小多肽Aβ的亲和力很高。 其后陆续发现AD病人中携带ε4等位基因者占46. 2%，而对照组占13. 2%。 还发现携带二个ε4等位基因的研究对象比携带一个ε4的研究对象发生AD年龄早，比不携带ε4等位基因的研究对象发生AD年龄更早，1994年，Schacher等人相继报道百岁老人普遍携带ε2基因。 。这一发现使ApoE多态性和研究向前迈出了一大步。 有报道高老年人携带ε2等位基因数量是年青人的2倍。 因此ε2等位基因似乎不仅可以保护人们免患AD，而且还与长寿有关。 ApoE多态性与AD的关系，目前的研究主要集中在脑代谢中与Aβ或Tau蛋白以及神经元生长和分枝等有关。 总之，在研究高脂血症评定心脑血管疾病的危险因素方面，以ApoE多态性为手段进行研究有重要的临床意义。 有学者认为，基因型的“坏”（ε4）和“好”（ε2）的等位基因之间的平衡，可作为基因分析应用于医学检验领域，协助临床疾病的诊断。 第五节　载脂蛋白（a）脂蛋白（a）[LP（a）]是1963年Berg研究β-脂蛋白的变异型时发现的，当时测定脂蛋白（a）在人群分布率为30%。 目前采用更灵敏的方法发现几乎存在于所有人群中，仅是血浆浓度差异很大，波动在0～1000mg/L的范围。 Eaton和Melean等于1987年克隆了人Apo（a）的基因序列，并推导出氨基酸序列。 结果提示了Apo（a）的分子结构与纤溶酶原极为相似。 Apo（a）含有一个疏水信号序列，其后为37个Kingle-4拷贝、1个Kingle-5及1个胰蛋白酶样区。 第36个Kingle-4含有一个额外未配对半胱氨酸，推测此处可能是Apo（a）以二硫键与ApoB结合的部位。 经胰蛋白酶限制性水解Apo（a）发现，Apo（a）中的Kingle-4有75%～85%的氨基酸与颖溶酶原的第391～472个氨基酸相同，有共同的抗原簇，表现出两者有交叉反应。 纤溶酶原（PG）是一种丝氨酸蛋白酶原，含有791个氨基酸残基。 结构中含有5个富含半胱氨酸的“Kingle”样结构，即Kingle-5，在Kingle-5的后面为一丝氨酸蛋白酶区。 PG与Apo（a）结构相似。 Kingle结构是三个二硫键组成的三套环形结构，含有78～82个氨基酸残基，在其第1与第6，第2与第4，第3与第5半胱氨酸上，连成三个二硫键。 这种结构也出现在前凝血酶，尿激酶，链激酶和纤溶酶原激活剂（t-PA）的组份中。 由于Apo（a）分子中的Kingle-4数目可在15-37之间变化，从而造成Apo（a）有多种不同的异构体。 Apo（a）结构中有一蛋白酶区，推测其功能可能是一种酶。 另外在分子中相当于PG蛋白酶的丝氨酸被精氨酸代替，即可使其丧失酶的功能。 由于Kingle结构与PG相似，推测Apo（a）可能结合到像PG受体或纤维蛋白那样的大分子上，再加上LP（a）颗粒携带的胆固醇结合到血管损伤部位，因此它不仅促进动脉粥样硬化形成，也阻碍血管内凝血块的溶解。 第六节　载脂蛋白DApoD是HDL中仅次于ApoAⅠ、AⅡ的一种载脂蛋白，在HDL2中约占21%，HDL3中占43%，VLDL中含有36%，ApoD化学本质是糖蛋白，其糖的组份中含有葡萄糖，甘露糖、半乳糖、葡萄胺和唾液酸。 ApoD又称为薄线肽（thinline peptide），其分子量为22100，为一条多肽链，C-末端为天冬氨酸、苏氨酸、丙氨酸和丝氨酸，N-末端是封闭的，正常人血清含量为100～120mg/L。 ApoD的生理功能尚不清楚，流行病学调查表明，ApoD与胆固醇酯尤其是HDL胆固醇之间存在着相关性，推测其可能是一种胆固醇转移蛋白，在胆固醇酯从HDL向VLDL的转移过程中起着重要的作用，也有不支持这一论点的实验依据，还有报道心肌梗塞和冠心病患者血浆ApoD水平与HDL-胆固醇水平呈正相关并同时降低。 ApoD水平可能与遗传因素有关，并与ApoAⅠ共同作为心血管疾病的早期预测指标。 第七节　载脂蛋白H人载脂蛋白H（human apolipoprotein H,ApoH）又称为β2糖蛋白Ⅰ（β2-glycoprotein,β2-GI），由Schultze等于1961年首先发现，它是人血浆中作为过氯酸可溶性部分存在的一种50kD糖蛋白。 ApoH是由326个氨基酸残基组成的单链多肽，其中含量最丰富的是脯氨酸（共31个），半胱氨酸共有22个，与二硫键的形成有关。 含有甘氨酸23个，并与胱氨酸共同形成高频β-转角所必需。 ApoH分子量为50kD，具有寡聚多糖的结构，含有5个分支糖胺寡聚多糖侧链，糖链占整个蛋白质分子的19%，系由半乳糖，甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖、岩藻糖及N-乙酰神经氨酸组成。 所有寡聚多糖均通过糖基受体序列Asn-X-Ser/Thr而连接到天冬酰胺位点上，分别位于143、164、169、174和234残基位置上。 受体序列中间位的“X”为色氨酸（Trp），且这两个Trp在蛋白链中都为同源位点。 因等位基因缺失可引起血清浓度异常，依此提出两个常染色体共显性等位基因-BgN（正常型）和BgD（缺失型）控制ApoH的表达模式：BgNBgN纯合子个体，其ApoH浓度在169～300mg/L；BgNBgD杂合子，血清浓度在60～140mg/L；而BgDBgD纯合子个体则＜50mg/L。 BgD缺失型等位基因出现频率在先天愚型人群中＞20%，比健康人群要高。 非遗传因素也可以起血清中ApoH含量的变化。 因ApoH基因变异，其结构存在多态性，目前认为编码相关的三个普通等位基因即ApoH1、ApoH2和ApoH3、还有ApoH4的存在。 三个常染色体的3个等位基因型决定了六种不同形式的表型，共同基因ApoH2出现频率高达90%。 在人血浆中占总量60%的ApoH存在于离心后d＞1. 21g/ml底层部分的游离脂蛋白中，余下部分则主要存在于富含TG的脂蛋白中，是CM、VLDL、LDL和HDL的组成成分，又是LPL的激活剂。 有报道，ApoH在ApoCⅡ存在时，能提高LPL活性45±17%，而ApoCⅢ则降低ApoH是ApoCⅡ赋予的LPL活性的77%。 ApoH还参与凝血机制，因为ApoH与血小板结合，使磷脂带阴电荷，从而减少凝血因子Xa、Va、Ca++与凝血酶原的结合位点或凝血酶原结合到血小板膜上后，通过调节腺苷酸环化酶活性来抑制ADP介导的血小板凝集，它作为一种血浆抑制因子，抑制内源性凝血旁路的接触激活。 在肾小管疾病中，ApoH的检测可作为早期肾小管损伤时的诊断指标，然而灵敏度尚不够高。 健康人血浆中ApoH浓度为193±30mg/L。 (周新　郑芳)（载脂蛋白的种类与结构）参考文献1．王克勤主编，脂蛋白与动脉粥样硬化，北京：人民卫生出版社，19952．Zannis V,Breslow J,Katz A,et al. 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Apolipoprotein E:An important gene and proteinto follow in laboratory medicine Clin Chem,1995,41:1068-108630. 杨振华,夏永静译. 载脂蛋白E:实验医学研究中的重要基因与蛋白质,交换资料,1995第四章　载脂蛋白基因结构及其基因型自80年代初期以来，随着分子生物学技术的发展和应用，载脂蛋白（Apo）AⅠ、AⅡ、AⅣ、（a）、B、CⅠ、CⅡ、CⅢ、CⅣ、D、E、F、H以及J的cDNA和基因已先后分离和鉴定。 这些载脂蛋白基因的染色体定位业已完成。 载脂蛋白cDNA及基因的鉴定以及染色体定位为深入研究载脂蛋白的结构与功能、载脂蛋白基因的表达与调控以及载脂蛋白基因的遗传变异与动脉粥样硬化的关系提供了新的工具。 已有大量文献报道了各种载脂蛋白基因的多态性。 有些多态性与异常的脂蛋白代谢以及早发动脉粥样硬化密切相关。 本章拟就各种载脂蛋白的基因结构及其基因型、载脂蛋白基因的染色体定位、载脂蛋白基因的多态性与动脉粥样硬化的关联作一简要介绍。 第一节　载脂蛋白基因结构载脂蛋白基因的分离是通过用相应的cDNA作为探针筛选基因文库而完成的。 比较基因的核苷酸序列与cDNA的核苷酸序列得以鉴定基因的内含子与外显子数目以及它们的分界线。 大部分真核细胞的基因含有内含子，内含子不编码氨基酸，但有些内含子参与基因表达的调控。 外显子通常占据基因内的三个区域：第一个区域不编码氨基酸，含有RNA转录起始以及导向mRNA至核糖体合成蛋白质的信号序列；第二个区域编码信号肽、前肽以及成熟蛋白质的部分氨基酸；第三个区域除编码成熟蛋白质的氨基酸外，还含有终止翻译以及添加聚腺苷酸的信号。 并非每个基因所含的内含子与外显子数目相等。 真核细胞基因的这些结构特点也体现在载脂蛋白的基因结构中。 有些载脂蛋白基因具有独特的结构特征。 本节重点介绍ApoAⅠ、AⅡ、AⅣ、CⅠ、CⅡ、CⅢ、E基因结构的类同性、载脂蛋白B基因的结构特点以及Apo（a）基因的结构特点。 其他的载脂蛋白基因结构均以列表的形式介绍。 一、ApoAⅠ、AⅡ、AⅣ、CⅠ、CⅡ、CⅢ及E的基因结构的类同性载脂蛋白AⅠ、AⅡ、AⅣ、CⅠ、CⅡ、CⅢ以及E的基因结构非常相似。 除ApoAⅣ缺少第1个内含子外，其余的载脂蛋白基因均由三个内含子与四个外显子组成（如图4-1所示）。 内含子的分布位置几乎相同。 第一个内含子截断5未翻译区，第二个内含子截断信号肽的编码区，靠近信号肽的切割部位，第三个内含子截断编码成熟蛋白质的区域。 尽管ApoAⅣ缺少第一个内含子，它的第二及第三内含子的分布与其他载脂蛋白相同。 载脂蛋白AⅠ、AⅡ、CⅠ、CⅡ、CⅢ、E基因的前三个外显子以及ApoAⅣ基因的前二个外显子的长度颇为相近，它们之间长度的不同主要取决于第四个或第三个（ApoAⅣ）外显子的长短。 这七种载脂蛋白基因结构的类同支持如下假说，即这些基因起源于一个共同的前体，通过部分或完全的基因重复的机制衍化而来。 图4-1 载脂蛋白AⅠ、AⅡ、AⅣ、CⅠ、CⅡ、CⅢ以及E的基因结构示意图宽方块代表外显子，细线代表内含子或5及3侧翼区。 在外显子区内：两端的空方块代表5及3未翻译区；斜线方块代表信号肽区；位于信号肽与成熟肽之间的窄空方块代表前肽（Prosegment）区。 图中的数值表示各个外显子的长度（核苷酸对的数目）。 （源出：L. Chan,Klin. Wochenschr. 67:227,1989）二、载脂蛋白B的基因结构与上述载脂蛋白基因的结构相比较，载脂蛋白B的基因结构具有显着的差异。 后者长达43000核苷酸碱基对，含有28个内含子与29个外显子。 其中外显子26与29分别长达7572与1906碱基对。 外显子26编码载脂蛋白B的第1379至3903个氨基酸，它比迄今为止所发现的哺乳动物基因的任何外显子都长3倍之多。 这种特长的外显子是否由一些短外显子融合所致尚不清楚。 在载脂蛋白B的内含子中，已发现有6种重复DNA序列。 其中某些特征序列模式已成为流行病学及家族研究的工具。 载脂蛋白B基因表达的产物有ApoB100和ApoB48，前者由4536个氨基酸组成，后者包含2152个氨基酸。 载脂蛋白B48是由小肠RNA剪切酶修饰ApoB信使RNA所产生的。 小肠ApoB信使RNA在第6666个核苷酸的位置上含U，而肝ApoB信使RNA的同一位置上为C。 由U取代C导致了一个终止翻译密码子（UAA）的产生。 UAA取代了编码ApoB100第2153个氨基酸谷氨酰胺的CAA密码子。 故在小肠ApoB基因表达的产物ApoB48仅含2152个氨基酸。 约占ApoB100组成的48%（见图4-2）。 这种ApoB信使RNA剪切机制在哺乳动物的分子生物学研究领域内是空前未有的先例。 这种机制的存在有何生理意义还待进一步的探讨。 图4-2 载脂蛋白B基因结构以及ApoB100与ApoB48合成示意图载脂蛋白B基因的29个外显子均由竖线表示出来，其中两个特长的外显子26个和29作了特别的标记。 位于外显子之间的28个间隙代表28个内含子。 图中的碱基对数目分别代表载脂蛋白B基因、载脂蛋白B100信使RNA以及ApoB48信使RNA的长度。 UAA和TAA为终止翻译密码子，CAA为编码谷氨酰胺的密码子。 （源自Young S G Circulation82(5):1597,1990）三、载脂蛋白（a）的基因结构载脂蛋白（a）的基因由10～45个内含子和11～46个外显子组成（见图4-3A）。 这种变异主要取决于Kringle（丹麦烤卷饼）-4功能区的数目，此数目可高达37。 其中24个Kringle-4功能区核苷酸序列完全相同，均由342核苷酸碱基对组成。 第24、27、28及29区仅相异于3个核苷酸。 其他的区有11～71核苷酸序列的不同。 Apo（a）基因的结构与血纤维蛋白溶酶原的基因结构相似（见图4-3A与图4-1B）。 其中信号肽编码区100%的等同。 其他区域的类似程度在75%～94%不等。 这提示Apo（a）与血纤维蛋白溶酶原基因由同一个前体衍化而来。 正是由于这个类同性，脂蛋白（a）不仅与脂类代谢有关。 而且也参与血液凝固的机制。 图4-3 Apo（a）与血纤维蛋白溶酶原基因结构(A)与cDNR结构(B)的比较在图4-3A中，数值Ⅰ-XIX标记的竖棒代表外显子的数目与序列。 外显子间的间隙为内含子。 在Apo（a）的基因结构中，n代表Kringle-4功能区的数目是变动的，可高达37。 在图4-3B中，S代表信号肽：T代表“尾巴”区；Ⅰ-Ⅴ分别代表Kringle-5功能区；P代表蛋白酶功能区。 血纤维蛋白溶酶原与Apo（a）各功能区的相似程度（%）标记在图B的下部。 （源自：Ichinose A. Biochemistry31:3115,1992 and Mclean et al. Nature 330:136,1987.）四、人体载脂蛋白基因结构一览表表4-1列出所有已经鉴定的人体载脂蛋白的基因结构，即内含子与外显子的组成以及基因表达后的产物信号肽、前肽及成熟肽的分布。 表中附有的文献索引供进一步查阅时参考。 表4-1 人体载脂蛋白基因的结构特征基因内含子外显子信号肽前肽成熟肽参考文献AⅠ341862436AⅡ34185777AⅣ23203778（a）10-4511-46194. 5294. 5B2829274. 5369CⅠ34265710. 2CⅡ34227911CⅢ34207912aCⅣ232510212bD452016913E341829914F**2228615G*H**1932616J89? 42717. 27*：尚未见有关资料报道。 第二节　载脂蛋白基因的染色体定位大部分人体载脂蛋白基因的染色体定位采用了两种方法：DNA印迹法（Southern blotting）；荧光标记原位杂交法（fluorescence insitu hybridization）。 DNA印迹法主要是分析从人与老鼠或中国苍鼠体细胞杂交体中提取的DNA。 如果人体某种载脂蛋白cDNA或基因DNA探针仅与含有特定人体染色体的体细胞杂交体DNA杂交，且不与同一杂交体内非人体染色体DNA交叉反应，这种载脂蛋白基因的染色体定位便可初步确立。 荧光标记原位杂交法使用荧光素标记的载脂蛋白DNA探针与固定的分裂中期的染色体杂交，这种方法可确立载脂蛋白基因在染色体上的特定位置。 这种定位的准确性可用某个染色体特异性的中心粒探针杂交进行佐证。 在已确立的人体载脂蛋白基因染色体定位中ApoAⅠ、CⅢ、及AⅣ在第11号染色体和ApoE、CⅠ及CⅡ在第19号染色体上的位置毗邻，而其他载脂蛋白基因的分布较分散。 一、载脂蛋白基因丛分布人体载脂蛋白基因AⅠ、CⅢ和AⅣ在第11号染色体上的位置毗邻，它们分布在22000个核苷酸碱基对之内，排列顺序为AⅠ-CⅢ-AⅣ。 AⅣ基因距AⅠ基因3末端12000个碱基对。 AⅣ的转录方向与AⅠ一致。 CⅢ基因位于AⅠ和AⅣ之间。 它的转录方向与AⅠ及AⅣ相反。 ApoE、CⅠ和CⅡ的基因分布在第19号染体上，它们之间的距离仅为4000核苷酸碱基对。 这三个基因以及6磷酸葡萄糖异构酶基因紧密相连地分布在中心体至长臂第13区段内。 低密度脂蛋白受体的基因亦分布在第19号染色体，不过它分布在短臂区域内。 这种载脂蛋白基因丛的分布可能反映这些载脂蛋白基因在进化的早期比较接近。 它们的表达可能受着协同的调控机制。 这种毗邻分布也具有临床意义。 其中一种载脂蛋白基因的多态性也可能与其毗邻的载脂蛋白基因的多态性或遗传特征有关。 二、载脂蛋白基因染色体位一览表表4-2列出载脂蛋白基因的染色体定位。 大部分载脂蛋白基因在染色体长臂或短臂上的位置均已确定。 表中列出的主要参考文献供进一步查阅其定位方法时参考。 表4-2 人体载脂蛋白基因的染色体定位基因染色体染色体区段基因座符号****参考文献AⅠ11q23-q末端*APOAI22AⅡ1q21-q23APOA223AⅣ11q23-q末端APOA422（a）***B2P24-p**APOB24CⅠ19q13. 2APOC121CⅡ19q13. 2APOC221CⅢ11q23-q末端APOC322D3q27-q末端APOD13E19q13. 2APOE25F12***APOF15G***H117q23-q末端APOH26J28P21CLI27*：q代表长臂；数值代表区段；**：p代表短臂；***：尚未见有关资料报导；****：参见计算机网络联系基因库(GDB:http:11www. gdb. orgl)；1：ApoH也称为β2-糖蛋白Ⅰ(β2-glycoprotein Ⅰ)；2:ApoJ也称为补体融解抑制剂(Complement lysis inhibitor,CLI),硫化糖蛋白2(Sulphatedglycoprotein2,SGP-2),gp-Ⅲ，SP-40，40，TRPM-2等。 第三节　载脂蛋白基因的多态性在人类进化过程中，基因的DNA序列在逐渐演变。 这种演变大都发生在氨基酸编码子以外的区域，称为“中性”变化，不导致临床疾病的发生。 但是，基因的氨基酸编码区以及基因表达的调控区的DNA序列改变时有发生。 导致蛋白质的合成量改变或基功能的异常。 载脂蛋白结构基因或其调控区DNA序列的突变引起致高脂血症或早发动脉粥样硬化已大量见诸于医学文献。 新的载脂蛋白基因的多态性不断地被发现。 检测载脂蛋白基因的遗传变异通常使用从外周血白细胞中提取的DNA为起始材料，通过聚合酶链反应扩增基因DNA的产量，嗣后，或采用变性梯度凝胶电泳（denaturing gradientgel electrophoresis, DGGE）显示由基因编码胺基酸区DAN序列突变所致的单股DNA构象的多态性；或使用等位基因特异的寡核苷酸探针杂交法（allele-specificoligonuc leotide hybridization，ASO）探测突变的等位基因；或测定限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）鉴定基因DNA序列的突变；或直接对某基因的片段进行DNA序列测定，与正常的相应的DNA序列比较，检测有否突变发生。 这几种方法为较常使用的方法。 有关这些方法的详细介绍可参见本书第十六章的生物化学检验技术篇。 本节主要介绍ApoB，ApoE,Apo（a）。 ApoAⅠ基因的多态性。 对其他载脂蛋白基因的多态性仅以举例的方式略述。 一、ApoB基因的遗传变异与多态性ApoB基因的遗传变异与多态性分以下几种类型进行介绍：①RFLP；②导致血浆胆固醇水平降低的基因突变；③导致血浆胆固醇升高的基因突变；④其他类型的多态性。 1．RFLP据报道，载脂蛋白B基因的限制性片段长度多态性至少375种。 后来发现有些多态性并非存在，纯属DNA序列测定错误。 表4-3列举了10种RFLP。 产生这些RFLP的突变或发生在ApoB基因上游启动子区域，或发生在内含子区域，或在外显子区域。 表4-3 ApoB基因限制性片段长度多态性举例惹限制性内切酶酶切位点突变等位基因出现频率酶切部位存在或缺失AvaⅡ距第1外显子上游4Kb0. 20缺失MspⅠ启动子区内，-265bp0. 21缺失ApaLⅠ第4外显子，cDNA的417bp0. 36缺失HincⅡ第4内含子内，距第3外显子3末端3334bp0. 12存在PvuⅡ第4内含子内，距5外显子5末端4523bp0. 08存在AluⅠ第14外显子内，cDNA的1981bp0. 48缺失BalⅠ第20内含子内，距第21外显子5末端146bp0. 50XbaⅠ第26外显子内，cDNA的7674bp0. 40-0. 50存在MspⅠ第26外显子内，cDNA的11040bp0. 12缺失EcoRⅠ第26外显子内，cDNA的12670bp0. 20缺失（源自：Young S G. Circulation 82:1583,1990）表4-3所列发生在外显子内的突变，除XbaⅠ限制性片段长度多态性外，其余均导致氨基酸改变。 已有很多研究者致力于研究常见的ApoB基因PFLP与高胆醇血症、高甘油三酯血症硬化的相关关系，但发现令人信服的相关关系的报道不是很多，还有的结果相互矛盾。 正如Young指出的那样，有的研究所使用的样本量太小；有的研究对照组的选择不合规范；有的研究基于不同的种族，忽视了正常的种族差异。 很显然。 在以后的相关研究中，尽可能选用大样本量，合理的选择对照组，考虑不同种族的正常遗传变异无疑对确证某些ApoE基因的RFLP与脂蛋白代谢紊乱的特殊表型以及早发动脉粥样硬化的关联尤为重要。 2．导致血浆胆固醇水平降低的ApoB基因突变经过许多实验室的努力，一些ApoB基因的无义突变或移码突变导致家族性密度脂蛋白血症均已鉴定（见表4-4）。 表4-4 ApoB基因突变导致短ApoB的合成ApoB的长度DNA水平上的突变短ApoB在血浆脂蛋白中的分布B-2在第5内含因子中，G颠换成T无B-9T替代C，使翻译在411号密码子后终止无B-25在第21外显子内有694bp缺失无B-27. 6在第24内含子内，剪接部位突变HDL，LDLB-29在第4152核苷酸上，T替代C无B-31cDNA核苷酸4480缺失HDL及密度大于1. 2g/cm3部分B-32在密码子1450上，T替代CHDL，LDLB-32. 5在4631核苷酸上，G替代THDL及密度大于1. 21g/cm3部分B-37cDNA核苷酸5391至5394段缺失VLDL，LDL，HDLB-39cDNA核苷酸5591缺失VLDL，LDLB-40cDNA核苷酸5693至5694段缺失VLDL，LDL，HDLB-46在cDNA核苷酸6381上，T替代CVLDL，LDL，HDLB-49. 6在cDNA核苷酸6963上，T替代CVLDL，LDL，HDLB-52. 8cDNA核苷酸7295缺失VLDL，HDLB-54. 8cDNA核甘酸7539缺失在cDNA核苷酸7655上，T替代CVLDL，HDLB-61在核苷酸8525处，有37bp缺失VLDL，HDLB-67cDNA核苷酸9327缺失LDL，VLDLB-74. 7cDNA核苷酸10366缺失LDL，VLDLB-82在核苷酸11411上，A替代CVLDL，HDLB-86cDNA核苷酸11840缺失VLDL，HDLB-87cDNA核苷酸12032缺失VLDL，HDLB-89cDNA核苷酸12309缺失VLDL，HDL(源自：Kane ,J. P. ,and Havel, R. J. In:The metalbolic and molecular bases of inherited disease,edited by Scriver, C. R. et al, Vol Ⅱ,p1868,1995,McGraw –Hill,Inc. ,New York,U. S. A)家族性低低密度脂蛋白血症的患者大多为杂合子，即他们携带一个正常的ApoB等位基因和一个变异的ApoB等位基因。 纯合子以及复合杂合子患者少见。 短ApoB合成的患者血浆中ApoB的浓度较低，仅为正常人ApoB等位基因产生的ApoB-100浓度的2%～10%，其机理尚未完全明了。 有人发现，含有ApoB87和ApoB89的LDL比含ApoB-100的LDL更易于被LDL受体摄取。 亦有人推测在杂合子患者中，由一个正常ApoB-100等位基因编码的ApoB-100与两个正常ApoE等位基因编码的ApoE组成的脂蛋白颗粒比正常的脂蛋白颗粒多含有1倍的ApoE，故前者易于被LDL摄取清除。 这些均有助于解释一部分短ApoB合成患者体内低浓度血浆ApoB及低浓度血浆胆固醇的机制有等进一步努力。 不难想到的是，家族性低低密度脂蛋白血症患者血浆中LDL胆固醇低，产生冠心病及动脉粥样硬化的危险性也降低。 已有一些报道证实，这些患者不产生动脉粥样硬化且寿命增长。 故有人认为，对惯常食用高饱和脂肪、高胆固醇饮食的北美人群，携带合成短ApoB的突变基因非但无害，反而有益于健康。 3．导致血浆胆固醇升高的基因突变。 Brown和Goldstein的经典研究，即LDL受体基因的突变，引起LDL清除障碍，LDL在血浆中蓄积，导致早发动脉粥样硬化，这是家族性高胆固醇血症的主要病因。 这些患者的血浆总胆固醇浓度高于7. 76mmol/L。 然而有相当一部分人的血浆胆固醇浓度在6. 47～7. 76mmol/L之间，与正常人相比为轻中度升高。 长期以来，人们一直推测ApoB基因遗传变异可合成有缺损的ApoB蛋白质，后者与LDL受体亲和力下降，引起LDL清除障碍，LDL在血浆中蓄积。 这种推测于1989年得到了证实。 Soria等人发现了家族性ApoB100缺损。 这些病人在其Apob cDNA第10708个核苷酸位置上，G转换成了A，导致ApoB100的等3500个氨基酸精氨酸变换成了谷氨酰胺。 这一突变使其LDL与LDL受体的结合力下降，产生高胆固醇血症。 据估计，这种突变在人群中的发生率与LDL受体的突变率接近，即1/500。 另一家族性ApoB100缺损是由ApoB基因第10800核苷酸位置上的C转换成T所致。 这一突变ApoB内第3531个氨基酸精氨酸变成了半胱胺酸。 8个患者的平均血浆LDL胆固醇水平在6. 78mmol/L，而8个未患ApoB基因突变的亲戚为3. 88mmol/L。 患者LDL对LDL受体的亲和力仅为正常对照组的39%。 由于C至T的转换，产生一个新的限制性内切酶切割部位（NsiI）,这将有助于在大范围人群内检测这种突变发生率。 4．其他类型的多态型距ApoB基因3末端500个核苷酸碱基对区域，有一DNA片段构成可变动数目的半联重复（variable number of tandem repeats. VNTR）已发现ApoB基因3末端这种VNTR所致的多态性与心肌梗塞的发作有关联。 ApoB信号肽由27个氨基酸组成。 在高加索种族人群中发现了两种多态性：一种为插入等位基因型，编码27个氨基酸；另一种为缺失等位基因型，编码24个氨基酸。 Visvikis 等人发现缺失等位基因型与高血浆ApoB 水平、LDL胆固醇水平、LP（a）水平以及总胆固醇水平有关。 最近Kammerer等人在34家共686名美籍墨西哥人中发现编码ApoB信号肽的三种等位基因：SP-24，SP-27，SP-29，它们分别编码24，27与29肽。 携带SP-24等位基因的纯合子其血浆ApoB与LDL胆固醇的浓度显著高于SP-27纯合子。 SP-29杂合子的ApoB与LDL胆固醇水平比SP-24纯合子还高。 二、ApoE基因的多态性ApoE在胆固醇与甘油三酯代谢中起着重要作用。 在正常人群中，10%以上的个体间血浆胆固醇水平的着异可归究于ApoE基因的多态性。 主要的ApoE等位基因有ApoE2、ApoE3和ApoE4。 ApoE3在人群中的出现率最高，被认为较常见的ApoE基因。 ApoE2与Ⅲ型高脂蛋白血症相关，而ApoE4在老年性痴呆病（Alzheimers disease）患者中的出现率较高。 这后一发现开拓了人们的视野，即ApoE不仅在脂类代谢中至关重要，而且在其他的代谢过程中也扮演重要角色。 已有报道，ApoE参与组织损伤的修复、免疫调节以及调控细胞生长与分化。 相信随着时间推移，更多新的ApoE功能及新的ApoE基因多态性会被发现。 表4-5列举了一些已鉴定的ApoE基因的遗传变异。 表中同时列出了密码子及其编码的氨基酸的改变、特定ApoE基因变异型首先被鉴定出的那个民族、出现频率、相关的高脂血症型以及遗传方式。 表4-5 ApoE多态性多态性名称1变异密码　子核苷酸改变氨基酸改变2种族背景分布率3高脂血症型4遗传方式常见的ApoE基因型---所有民族41. 9～91. 1%-ApoE4112TGC→CGCCys→Arg所有民族6. 4%～36. 8%N/HCApoE2158CGC→TGCArg→Cys大部分民族0. 0%～14. 5%N/FD陷性与FD相关的多态型ApoE0第3内含子A →G,G缺合成两种短肽美洲黑人14FD陷性3592bp-60失移码突变合成60肽德国人3FD陷性ApoE4-费城13GAG →AAGGlu →Lys拉丁美洲人7FD陷性145CGT →TGTArg →Cys拉丁美洲人陷性ApoE3-Leiden112TGC →CGCCys →Arg荷兰人>40FD显性21bp重复7个氨基酸患联重复ApoE1127GGC→GACGly→Asp高加索人>25FD未知158CGC→TGCArg→CysApoE2-Christchurch136CGC→AGCArg→Ser未报道3FD未知ApoE3112TGC→CGCCys→Arg拉丁美洲人6FD显性142CGC→TGCArg→CysApoE3--kochi145CGT→TGTArg→His日本人4FD未知ApoE2145CGT→TGTArg→His未报道3FD未知ApoE1- Harrisburg146AAG→GAGLys→Glu日本人高加索 人8FD未知ApoE2146AAG→GAGLys→Gln荷兰人美国人>40FD显性ApoE3华盛顿210TGG→TAGTrp→终止密码美国白人3FD陷性ApoE2 Fukuoka224CGG→CAGArg→Gln日本人1FD未知与非FD高脂血症相关的多态型ApoE53GAG→AAGGlu→Lys日本人0. 5%HC13GAG→AAGGlu→Lys法籍加拿大人6HC/HTGApoE2-Dunedin228CGC→TGCArg→Cys未报道2HTGApoE2236GTG→GAGVal→Glu荷兰人8HTGApoE7-Suita244GAG→AAGGlu→Lys日本人0. 5%～0. 8%HC/HTG245GAG→AAGGlu→CysApoE3112TGC→CGCCys→Arg荷兰人3HTG251CGC→GGCArg→GlyApoE1158CGC→TGCArg→Cys荷兰人2HC252CTG→GAGLeu→Glu与高脂血症无关的多态型ApoE4-+-Ferburg28CTG→CCGLeu→Pro德国高加索人0. 4%～0. 9%N112TGC→CGCCys→ArgApoE4112TGC→CGCCys→Arg荷兰人5N274CGC→CACArg→HisApoE4+296AGC→CGCSer→Arg荷兰人5NApoE584CCG→CGGPro→Arg美国白人0. 2%N112TGC→CGCCys→ArgApoE3-Freibaug42ACA→GCAThr→Ala德国高加索人1NApoE399GCG→ACGAla→Thr美国人1N152GCC→CCCAra→ProApoE2134CGG→CAGArg→Gln荷兰人5N1．除费城（Philadelphia）与华盛顿（Washington）两地名外，其他的地名均未翻译过来；2．氨基酸代号：Cys-半胱氨酸；Arg-精氨酸；Glu-谷氨酸；Lys-赖氨酸；Gly-甘氨酸；Asp-天门冬氨酸；Ser-丝氨酸；His-组氨酸；Gln-谷氨酰胺；Trp-色氨酸；Val-缬氨酸；Leu-亮氨酸；Thr-苏氨酸；Ala-丙氨酸；Pro-脯氨酸；3：分布率：加百分号的分布率是根据检测1000人以上的结果计算的；未加百分号的数值代表测出的携带ApoE多态型（包括纯合子与杂合子）的人数；4：缩写：N（Normal,正常）HC（hypercholesterolemia，高胆固醇血症）；FD（familialdysbetalipoproteinemia,家族性异常低密度酯蛋白血症，含Ⅲ型高脂蛋白血症）。 （源自：Knijff et al. Hum. Mutation4:181,1994）三、Apo（a）基因的多态性血浆Lp（a）的浓度与Apo（a）蛋白质的大小成反比，即Apo（a）的分子量愈大，则Lp（a）的浓度愈低；Apo（a）的分子量愈小，则Lp（a）的浓度愈高。 Apo（a）的分子量在400～800KDa之间。 按照Apo（a）在聚丙烯凝胶电脉时相对于ApoB100（分子量为520KDa）的迁移率，Utermann等人于1987年将Apo（a）归类为六种多态型；F比ApoB100迁移快；B与ApoB100迁移率相等；S1，S2，S3，S4比ApoB100迁移慢。 现已证实。 Apo（a）蛋白质的多态型是由Apo（a）基因中Kringle-4的数目变化而引起的。 Kring-4基因片段含有几个稀少的限制性酶切部位（NotI,SfiI. KspI,Sval,KpnI），这为加速筛选Apo（a）基因的多态性提供了帮助。 表4-5列举在奥地利北部Tyrolean区高加索人群中用KpnI作工具所测得的RFLP与1-4Kringe的数目、Apo（a）蛋白质的大小以及血浆Lp（a）浓度的关系。 表4-6 Apo（a）Kpni 片段与Apo（a）蛋白质多态型、Kringle-4功能区数目以及血浆Lp（a）浓度之关系表现分子量(KDa)KpnI片段(Kb)Kringle-4数目等位基因 数目平均Lp(a)浓度(mg%)KpnI片段频率(%)F＜45037-4911-131-3*＜0. 2B～50055-6614-164-661. 71. 2S1～55072-8217-197-934. 43. 8S2～60088-9920-2210-1224. 511. 2S3～650105-11623-2513-1510. 213. 7S4＞700121-21026-4216-32＜5. 770. 1*:样本量太小,资料缺如。 (源自：Utermann,G. In:The metabolic andmolecular bases of inherited disease. 7th ed, Vol. Ⅱ,eds. Scriver,C. R. etal. p1897,McGraw-Hill. Inc. ,New York,1995)由表4-6可看出，血浆Lp（a）的浓度亦与Kpn片段的大小成反比。 这为血浆Lp（a）与Apo（a）多态型的大小成反比从基因DNA水平提供了直接的证据。 Scana等人在Kringle-4第37个重复区（KIV-37，又称为KringleⅣ-10）检测出了两种突变：一种突变导致第72个氨基酸被精氨酸取代；另一种突变导致第66个氨基酸苏氨酸被蛋氨酸取代。 前者致使其Lp（a）不能与赖氨酸结合，且血浆Lp（a）浓度降低。 后者似乎与Lp（a）浓度无关。 Mooser等人报道在距第1第外显子5’端1. 3Kb区或内，由5个核苷酸[（TTT-TA）n]构成的VNTR与其血浆Lp（a）浓度相关。 此外。 亦有报道Apo（a）基因5’端侧翼区DNA序列的多态性控制血浆Lp（a）的浓度。 四、ApoAⅠ基因的多态性ApoAⅠ为HDL的主要结构蛋白。 ApoAI基因突变可导致异常的ApoAⅠ蛋白质的合成。 有些异常的ApoAⅠ影响HDL的代谢。 已报道的阻碍ApoAⅠ合成的基因突变有重排、缺失、无义突变等方式。 这些突变的纯合子患者表现出极低HDL胆固醇水平和早发冠心病。 目前已发现至少有20种不同的ApoAI结构基因的点突变导致氨基酸转换（见表4-7）。 其中两种突变（精氨酸173→半胱氨酸和脯氨酸165→精氨酸）与低HDL胆固醇水平相关，但并不引致早发冠心病。 Talmud等人发现ApoAⅠ基因启动子区域内距转录起始部位第75个碱基（-75bp）A置换G的突变与高ApoAI及HDL水平相关。 这种突变后的等位基因称为A等位基因，而含G的称为G等位基因。 Saha等报道A等位基因在新加坡华人中出现的频率（0. 27）高于高加索人(0. 12)。 Wang等人发现，ApoAⅠ基因第1内含子5末端，第83碱基C转换成T或第84碱基G转换成A，致使MspI酶切点丧失，这种突变与高HDL胆固醇相关，比上述的-75碱基A置换G突变与高HDL胆固醇的相关还强。 表4－7　人体ApoAI基因点突变导致氨基酸改变氨基酸改变1密码子2核苷酸点突变Pro3→ArgCCCC→GPro3→HisCCCC→APro4→ArgCCCC→GArg10→LeuCGAG→TGly26→ArgCGGCG→CAsp89→GluGATCT→G,T→AAsp103→AsnCGACG→ALys107→0Lys107→MetAAGA→TGlu136→LysCGAGG→AGlu139→GlyGAGA→GPro143→ArgCCAC→GGlu147→ValGAGA→TAla158→GluGCGC→GPro165→ArgCCCC→GGlu169→GlnCGAGG→CArg173→CysGCGCC→TArg177→HisCGCG→AGlu198→LysCGAGG→AAsp213→GlyGACA→G1：氨基酸代号可参见表4-5脚注；第1排氨基酸右上角的数值表示其在ApoAⅠ一级结构上的位置；2：加底线的核苷酸为点突变部位。 （源自：Eckardstein et al. J. Biol Chem. 265:8612,1990）五、其他载脂蛋白基因的多态性与以上介绍的ApoB、ApoE、Apo（a）以及ApoAI的基因一样，其他载脂蛋白的基因也存在多态性，以下简要地列举一些例子。 1．ApoAⅠ-CⅢ-AⅣ基因限制性片段长度多态性在ApoAⅠ-CⅢ-AⅣ基因丛内，使用XmnⅠ、ApaⅠ、MspⅠ、PstⅠ、SstⅠ、XbaⅠ、TaqⅠ和PvuⅡ限制性内切酶已检测出10多种RFLP。 尽管这些多态性大多由编码氨基酸以外的DNA序列突变所致,其中有些RFLP的携带者与增加冠心病的危险相关。 比如用限制性内切酶PstⅠ消化从人群中搜集的DNA后。 用ApoAⅠcDNA探针印迹DNA可测得3. 3Kb的DNA片段（称为P2等位基因）与2. 2Kb的DNA片段（称为P1等位基因）。 P1等位基因在正常人群中出现率较高。 P2等位基因在低HDL胆固醇患者中的出现率高于对照组的6倍。 来自英国与美国的报道亦证实，杂合子P1P2携带者血浆ApoAⅠ与HDL胆固醇的水平显著地低于P1P2基因型携带者。 这提示在ApoAⅠ-CⅢ-AⅣ基因丛中，PstⅠ酶切点的多态性，P2等位基因，与降低血浆ApoAⅠ和HDL的水平以及诱发冠心病有关。 最近，Dallinga-Thie等人在美国脂类研究杂志上报道，用限制性内切酶XmnⅠ与MspⅠ在ApoAⅠ-CⅢ-AⅣ基因丛内检测出的稀有等位基因与高血浆胆固醇、甘油三酯、ApoB以及LDL胆固醇水平相连。 这些结果显示，ApoAⅠ-CⅢ-AⅣ基因丛参与调节血浆胆固醇及甘油三酯的代谢。 2．ApoEⅠ-CⅠ-CⅡ基因限制性片段长度多态性位于第19对染色体上的ApoEⅠ-CⅠ-CⅡ基因丛也有多态性的存在。 检测出其RFLP的限制性内切酶包括：HpaⅠ、TaqⅠ、BglⅡ、DraⅠ、NcoⅠ以及BglⅡ。 Klasen等人报道，HpaⅠ限制性片段长度的多态性与易发Ⅲ型高脂血症有关。 然而HpaⅠ限制性片段长度的多态性与E2/E2基因型无关接关联。 这说明HpaⅠ的RFLP是不同于ApoE基因的一种独立的遗传因子，其突变点尚未阐明。 3．ApoAⅡ基因的突变Deeb等报道了在一对日本姐妹中检测出的家族性ApoAⅡ缺陷症。 冠状动脉造影显示这对姐妹未患血管疾病。 尽管免疫生化检验测不出血浆ApoAⅡ水平，患者HDL胆固醇在正常范围。 DNA分析显示，患者ApoAⅡ基因内第3内含子剪接供体部位的第一个碱基G突变成为A，从而阻碍了内含子从初级转录物中剪除掉的过程。 这无疑是导致ApoAⅡ缺陷的原因。 4．ApoAⅣ基因的多态性常见的ApoAⅣ等位基因编码ApoAⅣ的第360与347个氨基酸，分别为谷氨酰胺和苏氨酸。 当ApoAⅣ基因的第360密码子上第3个碱基T置换G后，正常的第360氨基酸位置上的谷氨酰胺被代之为组氨酸，当第347密码子上第1个碱基T置换A后，苏氨酸347→丝氨酸的变异即发生。 关于这两种ApoAⅣ基因多态性对脂类代谢的影响尚无一致的结论。 另一种突变，即密码子127的突变可致HincⅡ酶切位点的丧失。 最近Kamboh等人对西伯利亚中部的驯鹿牧民检测中发现，没有HincⅡ酶切位点等位基因的携带者血浆甘油三酯水平高于HincⅡ酶切位点等位基因的携带者。 5．ApoCⅡ基因的多态性载脂蛋白CⅡ基因的突变有四种类型被鉴定：a. 无义突变；b. 起动密码子的碱基突变；c. 第2内含子剪切供体部位突变；d. 由碱基插入或缺失所致的移码突变。 这些突变患者的血浆ApoCⅡ水平显著降低或缺失。 其遗传方式为常染色体隐性遗传。 6．ApoCⅢ基因的多态性已发现有三种ApoCⅢ基因多态性与高甘油三酯血症有关：a. 3175核苷酸C颠换成G；b. 3206核苷酸T颠换成G；c. 3206G等位基因。 Li等人不久前在临床研究杂志上报道，ApoCⅢ基因启动子内-482与-455碱基的突变与发生高甘油三酯血症有关。 作者推测这种突变正发生在受胰岛素抑制DNA序列范围内。 突变后的ApoCⅢ基因启动子摆脱了胰岛素的抑制调控，ApoCⅢ的转录大大加强，ApoCⅢ的合成增加。 这可能是人群中发生高甘油三酯的一个主要因素。 7．ApoD基因的多态性Vijayaraghavan等人检测了57个肥胖病人57名对照者ApoD基因TaqⅠ酶切位点限制性片段长度多态性：2. 2与2. 7Kb等位基因。 他们发现2. 2Kb等位基因在肥胖者中的分布显著地高于正常者。 这包括含有2. 2Kb等位基因的杂合子与纯合子，提示显性遗传方式。 作者认为，ApoD基因TaqⅠ限制性片段长度多态性可作为研究肥胖病的一个遗传标志。 8．ApoH基因的多态性ApoH基因第247密码子突变，致使第247个氨基酸缬氨酸被亮氨酸取代。 因为此突变使RasⅠ酶切位点丧失，故这种限制性片段长度多态性很易检测。 最近Kamboh等调查西伯利亚中部驯鹿牧民中三种ApoH等位基因ApoH1、ApoH2、与ApoH3的分布与血浆脂质水平的关系，他们发现ApoH等位基因与男子低甘油三酯水平相关。 而与女子高甘油三酯水平相关。 而女子高甘油三酯水平相关。 ApoH基因的多态性与脂质代谢的关系还有待于更广泛地、更深入地探讨。 9．ApoJ基因的多态性Kamboh暨同事报道，在对美国白种人、黑人、美洲印第安人、爱斯基摩人、新几内亚人及尼日利亚人6个民族共985名受试者的检测中。 他们发现了ApoJ有三种多态型，即ApoJ1、ApoJ2和ApoJ3。 ApoJ1存在于所有受试者基因内。 ApoJ2仅存于美国黑人与尼日利亚人黑人，出现频率分别为24%与28%。 ApoJ3仅从一美国黑人受试者测出。 造成此多态性的突变尚未见报道。 这三种“等位基因”似乎对总胆固醇、LDL胆固醇、HDL胆固醇、VLDL胆固醇、甘油三酯的水平没有显著的影响。 结论随着分子生物学技术应用于脂类代谢与动脉粥样硬化的研究领域，几乎所有被命名的载脂蛋白的cDNA与基因被分离与鉴定。 有关载脂蛋白基因多态性的报道与日俱增。 人们对脂蛋白代谢紊乱从分子缺陷的水平进行认识取得了长足的进展。 然而，各种载脂蛋白的生理功用尚未完全阐明。 近年来发现ApoE4与老年性痴呆有关，揭示了ApoE的新的功用就佐证了这一点。 对各种载脂蛋白的基因的各种多态性在所有种族间的分布进行系统的检测与分析还有待于进一步努力。 一些新的、简易的、准确的检测方法也有待于开发。 这些研究可望为载脂蛋白与动脉粥样硬化发病机制的探讨以及对动脉粥样硬化与冠心病的防治寻求新的措施开拓新的前景。 （叶永清）（载脂蛋白基因结构及其基因型）参考文献1. 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C端区呈一个折叠的柱状连接在球形的N端区，C端区的功能尚有争议，多数认为与介导酶与底物接触，形成活性的LPL同源二聚体以及间接参与酶解过程。 LPL在实质细胞的粗面内质网合成，新合成的LPL留在核周围内质网，属于无活性酶，由mRNA翻译合成的无活性LPL，称为酶前体，再糖基化后，才转化成活性LPL酶，如图5-1所示。 从细胞中如何分泌；目前认为有两种机制，其一是细胞合成的LPL后直接分泌，不贮存于细胞内，即称为基本型分泌；其二是调节型分泌，某些细胞新合成LPL贮存于分泌管内，一旦细胞受到一个合适的促分泌剌激。 LDL即分泌，此时分泌往往大于合成。 所有细胞都具备基本型分泌，只有少部分细胞兼有两种分泌形式。 Vannier提出，LPL是结合在插入细胞内分泌器并存在于细胞膜外表面的硫酸肝素糖蛋白（heparin sulphate protoglycans, HSPG），致使酶保持一种无活力的浓缩状态，然后通过一个尚未阐明的机制由肝素促使分泌，即肝素后血浆中得到活化的LPL，分布在含甘油三酯的脂蛋白中，并主要是分解CM和VLDL的甘油三酯并结合附着在这些脂蛋白残粒中，可能形成肝摄取这些颗粒的信号。 图5-1 LPL的合成二、LPL基因及其多态性LPL基因位于8P22，长约35kb，由10个外显子和9个内含子组成，编码475个氨基酸的蛋白质，包括27个氨基酸残基的信号肽。 现已查明外显子1长273kp，编码5端非翻译区和信号肽区。 外显子2～5长度分别为161、180、112和234bp，其中外显子2所编码的Asn43糖基化位点为LPL催化活性必需的，外显子4编码脂质结合区。 外显子6包含243bp。 编码肝素结合区。 外显子7～9长度分别为121、183和105bp。 编码结构参与与ApoCⅡ结合。 外显子10是LPL基因中最大的外显子，长1950bp，编码整个3端非翻译区。 LPL内含子7第序列尚未弄清，报道其中存在Alu重复序列和多态位点。 Jurke等研究发现LPL内含子7中有一完整的Alu序列，长282bp，位于内含子7第1027～746位。 Delin报道内含子6中也存在Alu序列。 Alu序列在人类基因组中约占3%-6%，推测其功能与基因转录的调节，hnRNA的加工以及DNA复制的启动有关，并且是基因重排的热点位置。 利用限制性片段长度多态性（RFLPS）技术检测出LPL基因位点存在多态性，主要分布在LPL基因内含子和侧翼序列中，其中内含子6中的PvuⅡ多态位点（图5-2）和内含子8中的HindⅢ（图5-3）多态位点与高脂血症有关，这为高脂血症的家系连锁分析提供遗传标记。 LPL基因转录起始点上游730bp区域是转录因子结合部位，5侧翼区一27位有“TATA”框，是LPL基因启动子所在部位。 图5-2　LPLPvuⅡ-RFLPM：DNA marder1:DNA-PCR产物（319bp）2-6：分别为P+P+、P+P-、P+P-、P-P-、P--、P+P+、H+H+基因型图5-3 LPL HindⅢ-RFLPM:DNA marker1～4:分别为H-H-、H-H+、H+H+、H+H-基因型三、LPL与Ⅰ型高脂血症Ⅰ型高脂血症为常染色体隐性遗传病，具有家族性。 主要临床症状为阵发性腹痛，疹状皮肤黄色瘤和肝脾肿大，生化特征为含高甘油三酯的乳糜微粒在因浆中大量堆积，脂肪耐量显着异常，LPL活性下降，这种患者体内的LPL含量可能完全缺陷，用目前的检测方法测不出LPL存在，也不可能在肝素注射后使血浆LPL活性下降，推测可能是一种异常LPL翻译后修饰所致。 引起Ⅰ型高脂血症常见的LPL基因突变有三类：一是碱基置换突变。 按性质又可分为错义突变和无意义突变，错义突变是指基因结构中某个碱基为另一个碱基取代，导致蛋白质分子中相应位置氨基酸改变，这类突变多集中在LPL活性中心所在的N端区，如Gly142、Ala176、Gly188、IIe194、Leu207、Arg243等，这些氨基酸被取代则LPL活性显著降低；无意义突变是指基因编码区发生突变后形成终止密码子，使翻译过程提前终止；导致合成肽链变短，Ⅰ型高脂血症发生与此类突变位点有关，若突变位点在第106位氨基酸的编码基因上，产生出来的短肽链产物不具有LPL催化功能，导致Ⅰ型高脂血症发生；突变位点在第447位氨基酸的编码基因（Ser447-Thr），其产物C端缺失2个氨基酸，不影响LPL活性：二是移码突变。 是指在DNA分子中插入或缺失一个或几个核苷酸（但不是3个或3的倍数）造成这一位置以后的一列编码发生移位错误的突变，这种突变有的会生成终止密码而使翻译过程提前终止。 有报道1例Ⅰ型高脂血症患者，其G916位碱基发生缺失，产生一个提前终止码，利用Northern印迹技术未检测到可测水平的LPLmRNA，推测此移码突变可能导致LPLmRNA稳定性下降；三是基因重排。 表现为大片段缺失或插入，目前发现外显子6中2kb插入，外显子9中3kb缺失，均导致I型高脂血症。 近年研究发现，1例Ⅰ型高脂血症患者脂肪组织中存在正常活性的LPL，肝素后的血浆中检测不出LPL存在，分析其脂肪组织中LPL化学组成，发现这种LPL的寡糖链含有较高水平的果糖，影响了LPL细胞内外的转运，提示翻译后的修饰异常也可影响LPL活性发挥。 脂蛋白脂肪酶基因突变点如表5-1所示。 表5-1 脂蛋白脂肪酶基因突变突变点位　置氨基酸异常（1）剪接突变GT→AT内含子2异常的mRNA生成AG→AA内含子2异常的mRNA生成（2）错义突变T→C外显子3Trp96→ArgA→G外显子4His136→ArgG→A外显子4Gly142→CluA→G外显子5Asp156→GlyG→A外显子5Asp156→AsnC→G外显子5Ala157→ArgG→A外显子5Gly176→ThrG→A外显子5Gly186→GluT→C外显子5Ile194→ThrC→G外显子5Asp204→GluC→T外显子5Pro207→LeuT→A外显子5Cys216→SerG→A外显子6Arg242→HisT→A外显子6Ser244→ThrG→A外显子6Asp250→AsnT→C外显子6Tyr252→His（3）无义突变T→A外显子3Tyr61→StopC→T外显子3Gln165→StopC→（A/G）外显子6Tyr282→StopG→A外显子6Trp282→Stop（4）插入2kb插入内含子6无效等位基因5kb插入外显子3外显子4的stop（5）缺失6kb的缺失内含子2～5无效等位基因1bp的缺失外显子5外显子5的stop第二节　肝脂酶Hahn最早观察到，对患高脂血病的狗进行静脉注射肝素，即引起患狗混浊的血浆变清，这是由于一种具有脂解活性的酶从组织的肝素结合位点上释放到血液中所致。 据此推测，这种脂酶是结合在细胞表面作为肝素受体的蛋白多糖，肝素竞争性地结合到细胞表面的蛋白多糖分子后。 脂酶被置换下来进入血液中，把引起血浆混浊的酯类物质水解，于是血浆由混浊而变清。 后来通过Sepharose-肝素亲和柱层析纯化，可从人的注射肝素后的血浆中得到两种不同的脂酶，一种被0. 6～0. 8mol/l NaCl液洗脱，不被高离子强度溶液抑制，不需要血浆辅助因子活化，肝脏切除动物的肝素灌注血浆中则不存在，因此，将此酶称之为肝脂酶（hepatic lipase,HL），此酶与早年Hahn观察到的脂酶是一致的。 另一种被1. 2～1. 5mol/l NaCl液洗脱的部分则具有LPL的性质。 肝脂酶 （hepatic endothelail lipase, HL或HTGL）是肝素化血浆中存在的另一种脂酶，属于与血液循环中内源性TG代谢有关的酶之一。 与LPL在功能上有相似之处，然而却是两种不同性质的酶，其特点是：①HL活性不需要ApoC-Ⅱ作为激活剂；②SDS可抑制HL活性，而不受高盐及鱼精蛋白抑制；③主要作用于小颗粒脂蛋白，如VLDL残粒，HDL同时又调节胆固醇从周围组织转运到肝，使肝内的VLDL转化为LDL。 经人及鼠cDNA克隆的DNA序列探明HLcDNA编码。 HL是共有2个N连接多聚糖链的糖蛋白，含有499个氨基酸残基，分子量53kDa，基因位于第15号染色体上，有合成氨基酸残基信号肽和476氨基酸残基的成熟肽的密码。 与分解代谢有关的丝氨酸位于145位。 LPL和HL的基因同属一组基因族，在进化上较为保守。 HL、LPL和胰脂酶（pancereaticlipase,PL）的性质有相似之处，也有不同点，如表5-2所示。 表5-2 LPL、HL和PL的异同点LPLHLPL底物CM、VLDL中的TGCM、VLDL代谢残粒和HDL的TG和磷脂胆汁酸乳化液中的TG辅因子血浆辅因子不需要辅脂肪酶合成部位脂肪组织、心肌和肌肉肝脏胰腺定位脂肪组织、心脏、肌肉血管的内皮细胞肾脏、肾上腺和卵巢血管的内皮细胞肠HL是肝实质细胞中合成，在合成过程中，酶蛋白的糖化及紧随着的低聚糖化修饰过程是分泌HL必要条件。 免疫电镜观察到HL位于肝窦状隙内皮细胞表面，在肝素化后，HL可释放到血浆，激素可调节HL的释放，主要是类固醇激素，如雄性激素可升高HL酶活性，而雌性激素则相反。 当怀孕或泌乳时，肝素后血浆中HL活力与血浆的游离胆固醇或类固醇呈负相关，肾上腺素抑制HL酶活性，另外胰岛素和甲状腺素在控制HL活力也亦有作用。 第三节　卵磷脂胆固醇酯酰转移酶卵磷脂胆固醇酯酰转移酶（lecihin:cholesterolacyl transferase,LCAT）由肝脏合成释放入血液中，是一种在血浆中起催化作用的酶，其作用是将HDL的卵磷脂的C2位不饱和脂肪酸转移给游离胆固醇，生成溶血卵磷脂和胆固醇脂。 血浆胆固醇中几乎70%～80%是胆固醇酯，均是LCAT催化生成所致。 LACT常与HDL结合在一起，在HDL颗粒表面活性很高并起催化作用，对VLDL和LDL的颗粒几乎不起作用。 在人工基质中添加ApoA-Ⅰ，促使LCAT的活性升高。 LCAT在磷脂代谢中起重要的作用。 LCAT由416个氨基酸组成。 分子量为6. 3kDa,属糖蛋白。 糖蛋白，糖链约占24%，是维持其活性必不可少的组分。 富含Glu、Gly、Pro和Leu。 每一酶分子含Cys，其中两个连成二硫键。 根据与胰脂酶序列的同源性比较，推测六肽：I178-G-J-S-L-G183可能是酶的活性中心。 LCAT中蛋白质α螺旋、β-折叠和其他的结构分别占21%、24%和55%。 LCAt mRNA约为1400bp组成，其信号肽是440个氨酸组成的密码子。 LCAT由肝脏合成并分泌至血浆，以游离或与脂蛋白结合的形式存在。 LCAT选择性底物是HDL，特别是新生盘状或小球形HDL3。 HDL核心是LCAT酶反应产物胆固醇的贮存库，并通过胆固醇酯转移蛋白将CE转移至其他脂蛋白和细胞膜，并与其交换。 LCAT除细胞合成外，在小肠、脾、胰、胎盘、肾上腺等组织发现有LCAT的mRNA，推测也可合成LCAT。 LCAT基因定位于16q22。 全长约4600kb，由6个内函子组成。 第四节　HMGCoA还原酶HMGCoA还原酶（HMGCoa reductase）是胆固醇合成的限速酶，存在于小胞体膜，催化合成甲基二羟戊酸（mevalonic acid），并生成体内多种代谢产物，称之为甲基二羟戊酸途径。 细胞内胆固醇水平调节主要信赖于内因性胆固醇合成途径和LDL受体摄取细胞外胆固醇的外因途径两条。 Goldstein ,Brown阐明其抑制机制认为，细胞内ch作为HMGCoA还原酶抑制剂使其活性降低，肝细胞膜上的LDL受体增加，从血中摄取ch增加，使血中胆固醇水平降低，设想HMGCoA还原酶活性降低的药物可使血中胆固醇水平下降，尤其是对FH的杂合子患者，LDL受体数锐减者可起治疗作用。 Kovanen等报导以merinolin的HMGCoA还原酶抑制剂投入，使狗血中LDL消失速度上升，LDL产生速度下降，肝移植的小儿FH纯合子患者，用梅维诺林治疗可使LDL胆固醇降低40%，而LDL产生速度下降35%，LDL合成减少的机制，有两种可能，一是胆固醇合成减少使VLDL生成量降低；第二是HMGCoA还原酶抑制剂使VLDL残粒或βVLDL异化增加，转变成LDL减少，体外实验也证实，从VLDL残粒到LDL的速度比正常状态下小20倍，与此同时LDL受体的亲和力也增加。 仓鼠HMGCoA还原酶基因长30kb，由20个外显子组成，在启动子5端富含GC碱基。 HMGCoA还原酶，从转录水平作为胆固醇代谢的调节点，与LDL受体基因启动子，HMGCoA合成酶，从转录调节域存在有相同的碱基系列，即CACCCC（或GT）AC的胆固醇调节元件（sterol regulatory element,SRE）存在，如图5-5所示。 图5-5 胆固醇代谢调节的启动子与SRE第一条线的数字为从转录开始的距离（碱基对数）（董学梅）（脂类代谢有关酶类）参考文献1．杨振华，酶的测定，见：叶应妩，李健斋，王玉琛主编。 临床实验诊断学，北京：人民卫生出版社，1991，588～4662．Paltarf F,Wagner E,Stereospecificity of Lipaseenzymatic hydrolyosis of enantiomeric aldyldiacyl and dialdylacylglyerols bylipoprotein lipase. 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Metabolism,1986,35:97098-,104:169322. 阵上久人，HMGCoa Reductaseとそのinhibiter . 最新医学，1992，47：82-90第六章　脂蛋白受体脂类在血液中以脂蛋白形式进行运送。 并可与细胞膜上存在的特异受体相结合，摄取进入细胞内进行代谢。 迄今为止，报道的受体已有很多种，研究最详细的是LDL受体，其次是清道夫受体，再就是VLDL受体，这三种受体的氨基酸序列。 构象及与配体的结合部位都已阐明，并且已成功地得到cDNA。 Brown和Goldstein于1974年研究家族性高胆固醇血症（familial hypercholesterolemia,FH）患者代谢缺陷时，在成纤维细胞膜上发现了LDL受体（LDl receptor,LDL-R）的存在。 以后相继发现有VLDL受体和清道夫受体。 脂蛋白受体在决定脂类代谢途径、参与脂类代谢，调节血浆脂蛋白水平等方面起着重要的作用。 脂蛋白受体的发现，是脂类代谢研究的里程碑，推动了脂蛋白、载脂蛋白的深入研究。 第一节　低密度脂蛋白受体Schneider等于1982年从牛肾上腺分离出LDL受体，以后又分离出编码牛LDL受体羧基末端1/3氨基酸的cDNA，并初步阐明了牛LDL受体cDNA，推导出人LDL受体的氨基酸序列。 一、LDL受体结构LDL受体是一种多机能蛋白，由836个氨基酸组成的36面体结构蛋白，分子量约115kD。 由五种不同的区域构成（见图6-1），各区域有其独特的功能。 图6-1 LDL受体与VLDL受体结构1．配体结合结构域配体结合结构域由292个氨基酸残基组成，其中共有47个半胱氨基酸，含有七个由40个氨基酸残基组成的与补体CB、Cq类似的重复序列，每个重复系列中有6个Cys残基，所有42个Cys残基均已构成二硫键，重复序列2、3、6、7是结合LDL所必需的，其中任何一种发生突变，均使受体丧失结合LDL的能力。 重复序列5则与结合β-VLDL有关，若该序列突变时，该受体结合β-VLDL的能力丧失60%。 该受体不仅能结合LDL，还能结合VLDL、β-VLDL和VLDL残粒；它不仅能识别ApoB100，也可识别ApoE的脂蛋白。 ApoE、B100为LDL受体的配体，因此，LDL受体又称为ApoB100，E受体。 2．EGF前体结构域 约由400个氨基酸残基组成的肽段，有5个重复序列，每个重复序列包括25个氨基酸残基。 EGF前体结构域与小鼠上皮细胞生长因子（epidermal growth factor,EGF）前躯体有同源性，这一区域因此而得名，Mutagenisis等在体外实验证实，这个区域的肽段，属于细胞膜外结构蛋白，起着支撑作用。 3．含糖基结构域 由58个氨基酸残基组成，是紧靠细胞膜面的肽段，由18个丝氨酸或苏氨酸构成0-连接糖链，对LDL受体起着支撑作用。 4．跨膜结构域 由22个氨基酸残基组成，富含疏水氨基酸残基，属于跨膜蛋白，起着固系于细胞膜中的抛锚作用。 这个区域缺陷，影响受体的细胞外分泌。 5．胞液结构域 位于细胞膜的胞浆侧，由50个氨基酸残基组成，C-末端位于胞浆并“深埋”于胞浆之中。 二、LDL受体基因结构人LDL受体基因长度45kD，由18个外显子和17个内含子组成共长达2535bp。 LDL受体基因如图6-2所示。 外显子1编码短的5侧序列及信号肽。 内含子1在信号肽远端2个氨基酸处中断编码序列。 配体结合域中的7个由40个氨基酸残基组成的重复序列中，第Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ残基序列均由各自的外显子编码，Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ则由同一个外显子编码。 EGF前体结构域由外显子7至14编码其蛋白的290～690氨基酸残基。 外显子15则编码LDL受体C末端的50个氨基酸。 LDL受体基因突变时可引起多种遗传疾病，典型遗传病有定族性高胆固醇（FH）。 LDL受体基因突变种类包括基因大片段的缺失或插入或仅有1个碱基的改变而导致形成错误或无意义的密码（见图6-2）。 通过基因水平分析，LDL受体基因突变不外乎下列几种类型：①一类是因基因突变使LDL受体蛋白无法检出或其活性丧失，这种突变涉及到mRNA转录水平变异。 如外显子1中缺6～10kb或外显子13～15kb缺失4～5kb；②另一类是因突变使分子量为120kD和ECG前驱体结构域抑制通过小胞体进入高尔基氏体的转送作用；③第三种是突变结果使LDL受体的结合LDL的能力降低；④第四种是受体结合LDL后不能内移，这种突变点在外显子16～18kb，即编码跨膜结构域的一段基因。 LDL受体的四种级别变异类型如图6-3所示。 图6-2 LDL受体基因结构及其家族性高胆固醇血症的基因突变和受体蛋白变异（引自 KajinamiK. Mabuchi H, Michishita I et al. Arteriosclerosis 8. 187. 1988）图6-3 LDL受体的生物合成与四种级别的变异类型(源自Brown MS, et al. 1986)三、LDL受体功能LDL受体广泛分布于肝脏、动脉壁平滑肌细胞、肾上腺皮质细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞，各组织或细胞的LDL受体活性差别很大。 含ApoB100的脂蛋白可以与LDL受体以高亲和力结合转运到肝脏，肠道分泌的ApoB48不是LDL受体配体。 所以肝脏不能清除完整的CM。 LDL或其他含ApoB100，E的脂蛋白如VLDL、β-VLDL均可与LDL受体结合，内吞入细胞使其获得脂类，主要是胆固醇，这种代谢过程称为LDL受体途径（LDl receptor pathway），该途径依赖于LDL受体介导的细胞膜吞饮作用完成，如图6-3所示。 当血浆中LDL与细胞膜上有被区域（coated region）的LDL受体结合（第1步），使其出现有被小窝（coated pit）（第2步），并从膜上分离形成有被小泡（coated vesicles）（第3步），其上的网格蛋白（clathrin）解聚脱落，再结合到膜上（第4步），其内的pH值降低，使受体与LDL解离（第5步），LDL受体重新回到膜上进行下一次循环（第6、7步）。 有被小泡与溶酶融合后，LDL经溶酶体酶作用，胆固醇酯水解成游离胆固醇和脂肪酸，甘油三酯水解成脂肪酸，载膜蛋白B100水解成氨基酸，见图6-4。 LDL被溶酶体水解形成的游离胆固醇再进入胞浆的代谢库，供细胞膜等膜结构利用。 胞内游离胆固醇在调节细胞胆固醇代谢上具有重要作用：若胞内浓度升高，可能出现下述几种情况：①抑制HCGCoA还原酶，以减少自身的胆固醇合成；②抑制LDL受体基因的表达，减少LDL受体的合成，从而减少LDL的摄取，这种LDL受体减少的调节过程称为下调（down regulation）；③激活内质网酰基CoA胆固醇酰基转移酶（acyl-Coa cholesterolacyltransferase,ACAT），使游离胆固醇在胞浆内酯化成胆固醇酯贮存，以供细胞的需要。 经上述三方面的变化，用以控制细胞内胆固醇含量处于正常动态平衡状态。 血浆中胆固醇主要存在于LDL中，而65%～70%的LDL是依赖肝细胞的LDL受体清除。 肝脏的LDL受体还影响LDL的合成速率及VLDL代谢。 曾经认为人VLDL几乎全部在血循环中转变为LDL，LDL再被肝外组织摄取，现在经大鼠和兔实验研究表明，VLDL仅有15%以下转变为LDL，人则有＜50%的VLDL转变为LDL，大部分VLDL是以VLDL或VLDL残粒的形式被肝脏摄取。 VLDL残粒与肝脏受体的亲和力比VLDL大很多，VLDL中虽有少量ApoE，因含有丰富的ApoC，可掩盖ApoE，而阻碍其与肝脏的ApoE、E受体结合，因VLDL转变成VLDL残粒时，随着甘油三酯水解而丧失ApoC，暴露出ApoE，因此，VLDL残粒被肝清除的速率比VLDL快。 VLDL残粒大部分被肝脏清除，一小部分在肝脂酶作用下水解除去甘油三酯而转变成LDL。 LDL受体还在乳糜微粒代谢中起有一定作用。 由于乳糜微粒中的ApoB48不能识别ApoB100，E受体。 所以肝脏不能清除完整的乳糜微粒。 但是血管中乳糜微粒被脂蛋白脂肪酶水解去除其大部分甘油三酯核心后，同时丧失部分ApoC、A，生成乳糜微粒残粒除去了阻碍ApoE与受体结合的因素，故可迅速被肝脏清除。 LDL约有一半是通过LDL受体，另一半通过LDL受体相关蛋白进行代谢，其半寿期短，总之，LDL受体主要功能是通过摄取胆固醇进入细胞内，用于细胞增殖和固醇类激素及胆汁酸盐的合成等。 图6-4 LDL受体胞吞作用示意图第二节　极低密度脂蛋白受体在ApoB100存在下，LDL受体可结合LDL；在ApoE存在下，既可结合LDL，又可结合VLDL、β-VLDL。 与LDL受体不同，还有一种仅与ApoE脂蛋白结合的特异受体存在，据以下临床现象及实验结果推测还有另一种受体的存在：①纯合子FH，患者血中乳糜微粒残粒并不增加；②LDL受体缺陷的WHHL兔乳糜微粒残粒仍正常地被肝脏摄取；③LDL受体下调状态下，乳糜微粒残粒可在肝脏异化，FH的LDL受体缺陷者或WHHL兔巨噬细胞不能利用LDL使其泡沫化，但可利用含ApoE脂蛋白的乳糜微粒残粒及β-VLDL使其泡沫化，所以推测有对ApoE特异结合的第二种受体存在，即极低密度脂蛋白受体（VLDl receptor, VLDL-R）。 利用cDNA单克隆已证明有VLDL受体存在，其结构与LDL受体类似，如图6-1所示。 有与LDL受体相同的五部分组成，即配体结合结构域，EGF前体结构域，含糖基结构域、跨膜结构域和胞液结构域。 然而并非完全相同，配体结构域，有55%相同性（图6-4）；EGF前体结构域有52%的相同性；含糖基结构域仅有19%相同性；跨膜域有32%相同性；胞浆域有46%的相同性，如图6-5、6-6所示。 LDL受体对含ApoB100的LDL，含ApoE的VLDL，β-VLDL，VLDL残粒有高亲和性。 VLDL受体仅对含ApoE的脂蛋白VLDL，β-VLDL和VLDL残粒有高亲和性结合并摄入细胞内，对LDL则为显著的低亲和性。 VLDL受体在能量代谢活跃的心脏、肌肉、脂肪等组织细胞存在，肝脏几乎未发现，这是因为与提供组织脂肪酸机能由LPL单独承担有关。 即①LPL分解结合在受体上的VLDL，水解得到的游离脂肪酸扩散通过细胞膜入细胞内，以提高利用率；②VLDL受体与LPL的mRNA有同一组织的特异性；③VLDL受体结合含ApoE的TG脂蛋白能力很强；④LPL缺损者皮下脂肪的蓄积不正常。 从这几方面去考虑，VLDL受体对富含TG脂蛋白代谢起有重要作用。 人VLDL受体与兔VLDL受体有97%的同源性，同人LDL受体有76%的同源性。 已证实它的mRNA在组织中高度表达的结果，对这些组织细胞的脂肪酸代谢功能具有重要的意义，如肌细胞、脂肪细胞、心脏、脑和胎盘细胞等。 图6-5 LDL受体与VLDL受体基因结构的异同示意图图6-6 LDL受体与VLDL受体的配体结合结构域及胞液结构域的比较配体结构域的VLDL受体和LDL受体均保留有SDE（Ser-Asp-Glu）序列，LDL受体有7个突变序列，VLDL受体则有8个重复系列。 以胞液结构域比较，LDL受体与VLDL受体均有被小窝信号肽（coated pit signal）的FDNPVY结构，其功能是与配体结合摄取进入细胞内。 另外LDL受体胞液结构域，在肝细胞内侧存在向基运输小窝（basipetal translocation pit）的[RNxDxx(S/T)xxS]结构，VLDL受体则无此小窝，如图6-6所示。 LDL受体受细胞内胆固醇负反馈抑制，VLDL受体则不受其负反馈抑制，当VLDL受体的mRNA量成倍增加时，不受LDL乃至β-VLDL的影响。 这是因为VLDL的配体关系使β-VLDL的摄取不受限制。 这一点，对由单核细胞由来的巨噬细胞的泡沫化在早期动脉粥样硬化的斑块形成中有重要意义。 VLDL受体在脂肪细胞中多见，可能与肥胖成因有关。 第三节　清道夫受体遗传性的LDL受体缺陷的杂合子是不能摄取LDL的，但动脉粥样硬化斑块的巨噬细胞有从LDL来的胆固醇酯大量蓄积并泡沫化，其原因用LDL受体途径无法解释，因为从这条途径不能摄取对过多的脂质。 同时经LDL受体摄入脂类的量是受细胞内胆固醇水平的调节。 Brown与Goldstein等使LDL乙酰化，从而导致不受细胞内胆固醇调节的过剩脂质也摄入并出现异常蓄积，进而推测存在一种LDL受体途径以外的脂质摄取途径，使巨噬细胞摄取乙酰化LDL。 Brown等人提出这种设想并定名为清道夫受体（scarenger receptor）。 以后许多实验证明了这种推测。 1984年Heinecke等人在细胞培养液中添加氧化剂使LDL氧化修饰，其结果使巨噬细胞摄取了这种变性LDL。 现在认为，人体内脂质过氧化反应导致的变性LDL，可被巨噬细胞无限制地摄人细胞内，这是因为变性LDL上带有各种分子的负电荷而与清道夫受体结合。 一、清道夫受体结构Komada等于1990年用配体亲和层析和免疫亲和层析，将牛肺巨噬细胞清道夫受体纯化，并由其部分氨基酸序列（见图6-7）克隆得到Ⅰ型、Ⅱ型清道夫受体cDNA，以后相继将人、兔和小鼠的清道夫受体cDNA克隆成功。 该受体C-末端为半胱氨酸的为Ⅰ型，具有短肽结构的为Ⅱ型清道夫受体。 以三聚体形式存在，分子量为22kD的膜糖蛋白。 N末端在细胞膜内侧，C末端在膜外侧存在，是“inside out”型的受体。 该受体的Ⅰ、Ⅱ型均由6个区域部分组成，如图6-8所示。 1．N-端胞浆域 由50个氨基酸残基组成，可能与包涵素结合，类似LDL受体结构。 其中央部分是磷酸化部位，摄取配体的最重得要的部位。 2．跨膜域（transmembrane） 由第51～76氨基酸残基构成。 为疏水性氨基酸组成的单一结构，“抛描”固定于细胞膜上。 3．间隔域 由第77～150氨基酸残基构成。 4．α-螺旋卷曲螺旋域（α-hericalcoiled-coil）由第151～271共121个氨基酸残基组成。 在这段蛋白中，其中含糖基结构域中有7个氨基酸残基组成的一含疏水性氨基酸的高氨酸拉链（leucine-zipper-helix）结构或者称为“七联体”，如图6-9所示，这种结构可以多达23个。 图6-7 清道夫受体氨基酸序列比较图6-8 清道夫受体结构模式图图1-9 清道夫受体的亮氨酸拉链结构图中为α-螺旋卷曲螺旋域中的螺旋轮示意图（人与牛）亮氨酸拉链结构的肽段先叠成右手α-螺旋，每一圈含3. 5个氨基酸。 尔后这些α-螺旋以疏水氨基酸中心构成的平行的三聚体结构。 该结构域内，亮氨酸与异亮氨酸残基出现部分对人则是分别为155～203和240～272氨基酸残位置。 5．胶原蛋白样域 属第273-343个氨基酸残基肽段，这种序列与胶原蛋白非常相似，推测这段肽链为右手胶原蛋白样三联体螺旋。 6．C端侧特异域 属第344～453个氨基酸残基肽段，为羧基末端。 该段富含半胱氨酸。 清道夫受体的8个Cys有6个在此域范围，所以称为清道夫受体富半胱氨酸域（scavenger receptor cystein rich domain like, srcR域）。 半胱氨酸的二硫键交联而成的区域非常紧密，牢固，形成球状，足以经受细胞外环境的变动，属于细胞外区域。 srcR域长约430nm，犹如三朵郁金香的“花苞”，有由间隔域到α-螺旋卷曲螺旋域构成的“花茎”为支撑，这一“花茎”约占总长度的52%或胞外部分的62%。 Ⅱ型清道夫受体没有srcR域，代之以6个氨基酸残基，所以是“截短”的清道夫受体。 但Ⅱ型清道夫受体比Ⅰ型清道夫受体具有高亲和力结合和介导内移修饰LDL作用。 二、清道夫受体配体清道夫受体配体广泛，有：①乙酰化或氧化LDL等修饰的LDL；②多聚次黄嘌呤核苷酸和多聚鸟嘌呤核苷；③多糖如硫酸右旋糖酐；④某些磷脂，如丝氨酸磷脂，但卵磷脂不是配体；⑤细菌脂多糖，如内毒素等。 这样广泛的配体谱的共同特点是多阴离子化合物。 Ⅱ型清道夫受体没有srcR域，但仍具有Ⅰ型相同的功能，显然配体结合域不在srcR域，推测其结构域在胶原蛋白样域C末端的22个氨基酸残基作为配体识别位点。 是结合多阴离子配体所必需的位点。 三、清道夫受体功能目前对于清道夫受体的功能还不十分清楚，是人们在研究巨噬细胞转变成泡沫细胞的机制时发现的。 近年来大量实验证明LDL可被巨噬细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞氧化成氧化LDL，可通过清道夫受体被巨噬细胞摄取，形成泡沫细胞，氧化LDL还能吸引血单核细胞粘附于血管壁，对内皮细胞有毒性作用等，从而促进粥样斑块形成。 这些研究无疑阐明了巨噬细胞的清道夫受体在粥样斑块形成机制中起有重要的作用，另一方面，也推测巨噬细胞通过清道夫受体清除细胞外液中的修饰LDL，尤其是氧化的LDL，是机体的一种防御功能。 可清除血管壁过多脂质；清除病菌毒素，摄取内毒素多方面的功能。 清道夫受体分布于胎盘，肝脏、脾脏等网状内皮系统，脑组织也有Ⅰ型和Ⅱ型。 清道夫受体不仅在组织巨噬细胞内发现有，在单核细胞分化由来的巨噬细胞侵入内皮的过程中也见有该受体。 兔、大鼠高脂肪膳食模型制作过程中，喂饲高胆固醇开始的的几天见到LDL样粒子附着于血管壁，其后有单核细胞附着于内膜、巨噬细胞导致脂肪线条病巢形成并出现成百成千巨噬细胞簇出现，此时发现有大量的清道夫受体，病灶逐步进入平滑肌细胞内膜，然而其深部巨噬细胞仅有少量残存受体，其量也逐渐减少。 当变性LDL显著增加时，清道夫受体摄取的脂质则不受制约，目前认为这是脂质沉积的重要原因，也是动脉粥样硬化发病的重要机制。 使LDL变性的主要因素是脂质的过氧化，而何种原因引起脂质过氧的，有待进一步研究。 （周新）（脂蛋白受体）参考文献1．刘秉文. 脂类代谢Ⅱ：磷脂、胆固醇及血浆脂蛋白代谢. 见顾天爵主编，生物化学. 北京：人民卫生出版社，19952．冯宗忱，低密度脂蛋白受体家族及清道夫受体，见：王克勤主编，脂蛋白与动脉粥样硬化，北京：人民卫生出版社，1995：278-3173．Hobbs H H,Brown M S,Goldstein JL. et alDeletion of exon encoding cystein-rich repeat of LDL receptor alters itsbinding specificityin subject with familial hypercholesterolemia. 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LDl Recepter-related Proteinの脈硬化巢の发现I. 第七章　脂类代谢有关的特殊蛋白质脂类代谢过程中的非极性CE和TG以及载脂蛋白，在脂蛋白之间进行转运和交换。 这种交换转运是否需要载体，如何转运，各脂蛋白之间的脂质和蛋白又如何达到平衡，早在60年代，人们已开始了饶有兴趣的研究。 1968年Akenumz与Glomset等发现血浆中有LCAT能催化HDL上Ch变成CE，转运到CM及VLDL或其他脂蛋白上，并很快达到平衡。 其后陆续有多种参与脂蛋白代谢的蛋白质因子被发现。 从蛋白质的生物学性质及功能看，这类蛋白因子似乎是酶，但又不具备酶学特征；似乎是受体，也不具备作为受体的特点，这种似酶非酶，是受体非受体的蛋白质，本章只好暂且称其为脂类代谢有关的特殊蛋白质。 第一节　胆固醇酯转移蛋白早在1975年，Zilvermit等发现兔血浆无脂蛋白部分含有使胆固醇酯转运的特殊蛋白质。 Barter等报道兔血浆d＞1. 21g/ml部分存在有促进脂蛋白和TG交换的蛋白因子，其后从高胆固醇血症兔血浆中分离得到这种活性蛋白，能促使HDL与LDL和VLDL之间进行CE交换，以后的研究中又发现这种质白质与动脉粥样硬化发生密切相关，这种特殊蛋白被之谓胆固醇酯转移蛋白（cholester ester transfer protein, CETP）。 一、CETP结构CETP又称为脂质转运蛋白（lipid transfer protein, LTP），从血浆d＞1. 21g/ml组份中精制得到，是由467个氨基酸残基组成的单链多肽，其中非极性氨基酸残基高达45%，是一种疏水性蛋白质，很容易被氧化而失活。 CETP由肝脏、小肠、肾上腺、脾脏、脂肪组织及巨噬细胞合成，细胞内成熟蛋白分子量为74000。 最近已阐明其结构编码基因存在于第16染色体。 与LCAT的基因靠近。 CETP基因由16个外显子和15个内含子约20. 5kb组成。 二、CETP生理功能CETP促进各脂蛋白之间脂质的交换和转运。 他催化HDL3上的胆固醇酯转运到富含ApoB的脂蛋白VLDL和LDL上，其中的TG经HTGL作用水解，使HDL颗粒缩小，CETP在完成和促进胆固醇逆转运过程中充当重要角色。 周围组织细胞膜的游离胆固醇与HDL结合后，被LCAT酯化成胆固醇酯，移入HDL核心，并可通过CETP转移给VLDL，LDL，再被肝脏的LDL及VLDL受体摄取入肝细胞，至此，完成了胆固醇从周围末梢组织细胞经HDL转运到肝细胞的过程，称之为胆固醇的逆转运，如图7-1所示。 图7-1 胆固醇逆转运系统目前认为，血浆中各脂蛋白的胆固醇酯主要通过LCAT和CETP的共同作用生成。 CETP与LCAT一样也常与HDL结合在一起。 三、CETP缺乏症血浆中CETP缺乏，HDL中CE蓄积TG降低，无法转运给VLDL及LDL，出现高HDL血症，从而使VLDL、LDL的CE减少及TG增加。 这是因为从HDL将CE转运给含ApoB脂蛋白的途径出现障碍所致。 利用酶联免疫方法检测血浆中CETP活性，其活性很低。 图7-2 LDL形成的两条途径因CETP的缺陷可引起高HDL血症，其中出现有富含ApoE和CE的类似于HDLc的多相分散LDL（polydisperse LDL）。 利用平衡密度梯度超速离心可使这种多相分散LDL显示出16个亚组份。 采用聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳，血胆固醇水平正常的人LDL仅显示一个单一的区带。 若CETP缺乏者，LDL可显示两条区带，其后进一步阐明，这两个区带是属于密度相同，其理化性质有差异的大小两种颗粒的LDL。 究其原因，是因为LDL的成熟过程有大LDL和小LDL途径，如图7-5所示。 ECTP的作用是促使HDL的CE转运到LDL中，使其形成成熟均一的LDL，CETP是LDL成熟的必]需因素。 利用酶联免疫法测定CETP缺陷者，血清CETP水平低于健康人，其量与HDL-C呈负相关。 实验证明，CETP缺陷的纯合子，转运CE的作用完全丧失。 经PCR及DNA测序确认，CETP缺陷常在基因内含子14的剪接供体位点上易发生G→A突变。 据报道，CETP缺陷者可出现于杂合子，又可出现于纯合子。 据此推测，CETP缺陷者可能是一种复合型异型合子（compound heterozygote）。 CETP缺陷是引起高HDL血症的原因，然而血浆中CETP的活性差异很大。 血浆CETP活性低的动物，胆固醇负荷实验发现，很易引起动脉粥样硬化，而HDL-C呈高值；CETP活性高的动物进行胆固醇负荷实验发现，也很容易引起动脉粥样硬化，然而HDL-C为低值。 这种有趣的现象令人费解。 然而最大的可能是，CETP以几种不同的表型发挥着不同的生理功用之故。 因此，与其说CETP的某一表型是CE转运蛋白还不如说是致动脉粥样硬化的因子。 总之，CETP缺陷是引起动脉粥样硬化的重要因素之一。 第二节　血清碱性蛋白高载脂蛋白β脂蛋白血症（hyperapo beta lipoproteinemia ,HyperApoB）属遗传性脂代谢紊乱性疾病，以小而致密的低密度脂蛋白（LDL）微粒升高为主要特征，后者是冠心病的重要危险因素之一。 HyperAopB的代谢缺陷为：①肝组织大量合成VLDL，致使小而致密的LDL水平升高；②餐后TG水解延迟，大量游离脂肪酸堆积在血液中。 到目前为止，用ApoB基因缺陷或突变无法解释HyperAopB的各种表型，已发现来源于该病患者的脂肪细胞和成纤维细胞对游离脂肪酸的吸收和代谢存在明显障碍。 Kwiterovich等正常人血清中分离出三种碱性蛋白质分子（basicproteins,BPs）-BPⅠ（Mr14. 0kD,pI9. 10），BPⅡ(Mr 27. 5kD,pI8. 48),BPⅢ(Mr55. 0kD,pI8. 73)，并认为BPⅠ同Cianflone等人分离纯化的酰化作用剌激蛋白（acylation-stimulating protein,ASP）系 同一种蛋白质。 同正常人成纤维细胞相比，BPⅠ使HyperApoB患者成纤维细胞合成甘油三酯和胆固醇酯的能力下降约50%，而BPⅡ则明显促进患者成纤维细胞合成胆固醇酯，BPⅢ对这两种不同来源的成纤维细胞的代谢没有影响。 然而，与BPⅠ和BPⅡ不同的是，BPⅢ能显著促进正常人单核源性巨噬细胞合成胆固醇酯。 BPⅠ和BPⅡ主要通过蛋白激酶C（PKC）和酪氨酸蛋白激酶（TPK）途径传递信息和发挥生物效应。 由于BPs与正常人脂质、脂蛋白和游离脂肪酸的代谢以及HyperAopB的病理生理变化密切相关，受到人们的普遍关注，尤其是血浆脂质代谢与补体系统之间的关系已成为许多实验室研究的热点。 一、血清碱性蛋白质的分离及其氨基酸的组成分析最初在培养离体成纤维细胞和脂肪细胞时，偶然发现培养基中加入血清可使细胞甘油三酯（TG）的合成量增加，后来证明这是因为血清中含有一种呈碱性的蛋白质分子，根据这一特性，1988年，Cianflone采用层析法将这种蛋白质分离出来，并依据其生理功能命名为酰化作用剌激蛋白，该蛋白质分子量为14. 0kD，等电点为9. 10。 1989年Kwiterovich采用IEF和SDS/PAGE技术从人血浆中分离纯化三种碱性蛋白质分子，并测得其分子量和等电点分别为：碱性蛋白Ⅰ（BPⅠ）14. 0kD,9. 10；碱性蛋白Ⅱ(BPⅡ)27. 5kD,8. 48；碱性蛋白Ⅲ（BPⅢ）55. 0kD. 8. 73。 分析这三种碱性蛋白质，发现他们分别由不同的氨基酸组成：BPⅠ精氨酸的含量约为BPⅡ、BPⅢ的两倍，半胱氨酸含量为BPⅢ的三倍；BPⅡ不含半胱氨酸而富含脯氨酸；BPⅢ蛋氨酸的含量是BPⅠ、BPⅡ的2～3倍，而组氨酸的含量只有BPⅠ、BPⅡ的一半，BPⅢ还富含丝氨酸。 另外，这三种蛋白质都含有较丰富的非极性氨基酸，因此当用葡聚糖或聚丙烯酰胺对其进行层析法分离时，观察到的相反的现象可能是这些氨基酸在水相中相互作用的结果。 而组成该蛋白质分子的Asn/Asp和Gln/Glu都以酰胺基团形式存在，保证了这些蛋白质分子的等电点呈碱性。 Kwiterovich采用免疫印迹分析表明：BPⅠ只能同抗ASP免疫血清发生特异性反应，与免疫前血清无反应。 而BPⅡ和BPⅢ都能与抗ASP免疫血清和免疫前血清发生反应，因此没有理由相信BPⅡ和BPⅢ与ASP是同一种物质，但Kwiterovich认为BPⅠ和ASP为同一种物质，因为许多实验结果也显示BPⅠ和ASP具有相似的等电点、分子量和氨基酸组成，而且都具有酰化作用激活性，但目前还没有BPⅠ和ASP分子克隆的结果证实这一结论，见表7-1所示。 表7-1 碱性蛋白Ⅰ和酰化作用剌激蛋白氨基酸组成分析残　基碱性蛋白Ⅰ酰化作用剌激蛋白摩尔组分整　数摩尔组分整　数Asp/Asn9. 471210．314Clu/Gln11. 761514．119Ser5. 7576．69Gly9. 111211．716Arg8. 25105．88Cys3. 0145．47Thr5. 1674．97Ala7. 54108．211Val5. 2374．86Met1. 5921．52Ile3. 6152．74Leu8. 03106．28Phe3. 6153．24His2. 9541．42Lys6. 7595．27Pro5. 0265．27TrpNDND残基总数129135分子量14335Da14514Da等电点9. 109. 10氨基酸组成分析也证实BPⅠ和ASP都含有丰富的半胱氨酸，可以凭借其形成二硫键产生广泛的生物学效应,一般这些半胱氨酸残基都以氧化的形式存在,当采用含β-巯基乙醇的缓冲液来纯化ASP时,其生物活性会完全丧失,可见半胱氨酸的存在对维持其酰化作用剌激活性很有必要. 现已证明，BPⅠ、BPⅡ、BPⅢ的生理功能不同于胆固醇转运蛋白（sterol carrier protein ,SCP）和脂肪酸连结蛋白（fatty-acidbinding protein ,FABP），也不同于其他碱性蛋白如髓鞘碱性蛋白（MBP）。 二、血浆碱性蛋白对细胞脂质代谢的影响碱性蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ都具有酰化剌激活性，能剌激成纤维细胞合成TG，胆固醇酯（ChE）和磷脂（PL）。 1994年，Peter分别采集了6个健康成人和6个家族性高载脂蛋白β脂蛋白血症患者的成纤维细胞进行细胞脂质代谢的研究：在正常人培养的成纤维细胞中，BPⅠ、BPⅡ和BPⅢ分别使其细胞内甘油三酯（TG）的含量增加2、1. 5和1. 4倍；但在HyperApoB患者成纤维细胞中，BPⅠ的作用下降了50%，而BPⅡ和BPⅢ仍能发挥其有效的酰化作用剌激活性。 在正常成纤维细胞，BPⅠ也有剌激胆固醇酯合成的能力，而在HyperApoB患者成纤维细胞，BPⅠ的这种作用基本上消失了。 但BPⅡ能使HyperApoB患者成纤维细胞内胆固醇酯的含量异常升高至正常细胞含量的六倍，而且BPⅡ对胆固醇酯和总胆固醇的影响是平行的，游离胆固醇未发现有何变化。 BPⅠ还可使正常细胞总磷脂含量升高约两倍，而在HyperApoB患者成纤维细胞，BPⅠ对磷脂的合成代谢影响甚微，只相当于正常细胞约三分之一的能力。 已有研究表明，未用碱性蛋白（BPs）处理的正常细胞和HyperApoB患者细胞，其脂质代谢无显著性差异，表明碱性蛋白（BPs）的作用机制可能是加速细胞合成脂质或抑制细胞内脂质的水解。 Teng等发现在正常人脂肪细胞，ASP（或BPⅠ）的作用是促使甘油三酯（TG）合成增加而不是抑制了细胞内甘油三酯的水解，同样，在HyperApoB患者脂肪细胞内甘油三酯的减少不是由于（BPⅠ）使甘油三酯水解增加而是使其合成减少。 因此Kwiterovich认为BPⅠ促进正常细胞合成甘油三酯，而HyperApoB由于存在某些缺陷限制了BPⅠ的酰化剌激活性。 三．不同脂质、脂蛋白和LDL-ApoB浓度下碱性蛋白对细胞代谢的影响Kwiterovich 选择正常人和家族性高载脂蛋白β脂蛋白血症患者成纤维细胞进行培养，分别观察碱性蛋白Ⅰ、Ⅱ在不同脂质、脂蛋白和LDL-ApoB浓度下对细胞油酸代谢的影响，结果发现BPⅠ剌激油酸转化为甘油三酯的比率与血浆总胆固醇、甘油三酯、LDL-C和LDL-ApoB水平呈显着性相关（P＜0. 01），同血浆高密度脂蛋白浓度正相关（P＜0. 05），相似的关系也见于油酸转化为胆固醇酯的过程中。 因此认为BPⅠ可能影响HyperApoB的病理生理过程，对各种表型的形成起重要作用。 如总胆固醇、甘油三酯、LDL-ApoB浓度越高，则高密度脂蛋白浓度越低。 而Cianflone则认为，除了家族性高胆固醇血症，酰化作用剌激蛋白（ASP）诱导成纤维细胞合成甘油三酯的量与血浆低密度脂蛋白水平呈负相关，与血浆高密度脂蛋白和极低密度脂蛋白水平无关。 同BPⅠ相反，BPⅡ诱导胆固醇酯合成的量同血浆总胆固醇、LDL-C和LDL-ApoB的浓度呈显著性正相关（P＜0. 01），同血浆高密度脂蛋白水平呈负相关（P=0. 06），同血浆甘油三酯的浓度有正相关趋势（P=0. 01）。 同样，BPⅡ剌激高载脂蛋白β脂蛋白血症患者成纤维细胞合成胆固醇酯的能力与血浆高水平的LDL-C和LDL-ApoB密切相关，血浆高水平的LDL-C和LDLApoB为BPⅡ促进胆固醇的大量酯化创造了良好的条件。 碱性蛋白Ⅱ（BPⅡ）可能以不同于碱性蛋白Ⅰ（BPⅠ）的方式影响血浆LDL浓度：BPⅠ主要通过影响外周细胞（如脂肪细胞）而发挥生物效应，因为在HyperApoB患者外周细胞对游离脂肪酸的转化降低；而BPⅡ则促进肝组织对游离脂肪酸的吸收并剌激肝细胞合成分泌载脂蛋白B。 碱性蛋白Ⅲ（BPⅢ）能显著剌激单核细胞源性巨噬细胞合成胆固醇酯，而对甘油三酯的代谢无影响。 BPⅠ和BPⅡ对单核源性巨噬细胞的甘油三酯和胆固醇的代谢没有影响，表明碱性蛋白生物效应可能具有细胞特异性。 四、酰化作用剌激蛋白与细胞的连结同正常人成纤维细胞一样，酰化作用剌激蛋白（ASP）能明显促进家族性高胆固醇血症和LDL-ApoB水平正常的IV型高脂蛋白血症患者的成纤维细胞合成甘油三酯，并且ASP与成纤维细胞结合具有一定的特异性，结合曲线可呈饱和状态，表明家族性高胆固醇血症和LDLApoB水平正常的IV型高脂蛋白血症患者，同正常细胞一样具有同一类ASP受体，而且该受体的最大亲和力与正常对照组基本一致。 研究表明，ASP与正常细胞和HyperApoB细胞连结的典型曲线为矩形双曲线。 Scatcharel线性回归分析表明，正常细胞的斜率为-0. 068±0. 01(μg/ml)-1而HyperApoB患者细胞的斜率为-0. 08±0. 02(μg/ml)-1统计学无显著性差异，而HyperApoB细胞x轴截距只相当于正常细胞的一半这些结果表明，ASP与正常细胞和HyperApoB患者细胞表面受体的连结都呈单级式，kD值为1. 05×10-6M，只是HyperApoB细胞表面受体下降了一半。 但有研究表明，只有约50%的HyperApoB患者细胞存在这种缺陷，且此种缺陷与高脂血症的严重程度无关。 Babirak则认为脂蛋白脂肪酶的活性缺失也可能导致高载脂蛋白β脂蛋白血症，而并未发现该患者的外周细胞表面的酰化剌激蛋白受体有所减少。 同胰岛素相比，ASP可能更有促进脂肪组织合成甘油三酯的潜力，对餐后脂肪酸的分布发挥其重要作用。 ASP调节外周脂肪组织吸收脂肪酸合成甘油三酯，迅速解除游离脂肪酸对脂蛋白脂肪酶（LPL）活性的抑制，促使LPL更有效地水解餐后升高的甘油三酯，并改善LPL对富含甘油三酯的脂蛋白的清除，而HyperApoB患者由于细胞膜ASP受体数目降低，外周组织不能有效地利用血浆中的脂肪酸和葡萄糖，致使大量脂肪酸重新分布到肝组织，剌激肝细胞合成并分泌大量ApoB，装配VLDL和LDL。 五、碱性蛋白的信使传递途径碱性蛋白Ⅰ和碱性蛋白Ⅱ可能是通过第二信使系统介导而影响细胞甘油三酯和胆固醇酯的代谢。 Peter选择蛋白激酶C（PKC）的激活剂和抑制剂来研究BPⅠ、BPⅡ的作用途径，H-7是PKC较为有效的抑制剂，其作用是参与ATP竞争而不是与Ca2+或磷脂相互作用，实验结果表明，H-7抵消了HyperApoB患者细胞对BPⅠ的反应性，而且HyperApoB患者细胞对BPⅡ异常反应也被高浓度的H-7所遏制。 在缺乏BPs时，PKC的激活剂C：8能同样有效地剌激正常细胞和HyperApoB患者细胞，表明在HyperApoB细胞，经甘油二酯（DG）途径激活PKC的过程无异常。 但当BPs存在时，HyperApoB细胞的代谢缺陷并不因为PKC的激活剂C：8的出现而有所改善，所以HyperApoB的代谢缺陷不是在DG-PKC途径，而在第二信使系统的其他环节上。 Baldo也认为ASP是通过蛋白激酶C（PKC）途径介导而发挥生物效应的，因为PKC的激活剂豆寇酰佛波乙酯（PMA）和1-油酰基-2-乙酰-rar-甘油（OAG）能模拟ASP的生物效应，当成纤维细胞对PMA和OAG的反应性处于饱和状态时，改变培养基中的ASP浓度，并不能使甘油三酯的合成增加；PKC特异性抑制剂星形孢菌素Cal-phostinC和GF109203x也可完全抑制ASP的生物活性；ASP可使细胞内DG合成增加，而DG是PKC的有效激活剂；ASP激活PKC从胞浆转位到细胞膜，使细胞膜对脂肪酸的吸收和葡萄糖的转运增加。 为了进一步明确HyperApoB患者的细胞变异环节，1995年，Kwiterovich采用染料木黄酮（genistein）作为探针来研究正常细胞和HyperApoB患者细胞对BPⅠ的反应性。 结果显示木黄酮存在时正常细胞和HyperApoB患者成纤维细胞的脂质代谢存在明显差异，可以推测酪氨酸蛋白激酶（TPK）的磷酸化在HyperApoB病理生理过程中扮演重要角色，且这一现象也被其他两种TPK抑制作用所证实（herbimycinA和tryphostinA47）。 在缺乏BPⅠ的F-12培养基中补充木黄酮（92. 5nmol/ml），正常细胞甘油三酯含量下降10%，而HyperApoB患者成纤维细胞中总胆固醇和非酯化胆固醇含量下降25%。 正常成纤维细胞和HyperApoB患者成纤维细胞中总胆固醇和非酯化胆固醇的量都显著减少，且HyperApoB患者成纤维细胞这两种脂质下降更显著，还没有发现成纤维细胞内胆固醇酯有何变化。 当用BPⅠ和木黄酮（或者herbimycinA、tryphostinA47）处理培养基后，正常细胞合成甘油三酯的量与只用BPⅠ处理HyperApoB细胞合成甘油合成甘油三酯的量一致。 这些现象表明，BPⅠ的生物活性，是通过位于细胞膜上TPK所介导的HyperApoB细胞，对BPⅠ反应性缺失，由于TPK的磷酸化为一些TPK的抑制剂所阻断，经木黄酮处理的正常细胞和HyperApoB细胞仍对BPⅠ有一些残余反应，其机理有待进一步探讨。 非受体型TPK包括SH2和SH3两个功能域，通过磷酸化作用，激活跨膜受体TPK，实际上SH2和（或）SH3蛋白是磷脂酶C-r（PLC-r）、ras-GTP酶活化蛋白（ras GAP）和磷脂酰肌醇3激酶（pI-3K）的同系物，其功能是裂解4，5二磷脂酰肌醇为DG和三磷酸肌醇（IP3），因此这些SH2和SH3蛋白也具有TPK活性，并放大TPK的信号，最终将其传到核内的转录机构，以调节特定基因的表达或通过改变细胞内蛋白的功能状态，使细胞的代谢水平发生变化，已证实HerbimycinA直接抑制PLC-r。 因此，HyperApoB的细胞缺陷可能存在于跨膜受体TPK，也可能存在于原型细胞质信号蛋白的识别和结合方式。 从目前的资料来看，木黄酮对BPⅠ生物活性的抑制不是通过降低HMGCoA还原酶的活性而实现的，因为木黄酮能抑制甲羟戊酸内酯转变成非酯化胆固醇，而不能抑制HMGCoA还原酶的磷酸化。 Sato已经阐明HMGCoA还原酶的磷酸化可降低其催化能力，如果木黄酮抑制了HMGCoA还原酶的磷酸化，那么将使胆固醇的生物合成增加而不是降低，但是这样无法解释经木黄酮处理的正常成纤维细胞和HyperApoB细胞内总胆固醇和非酯化胆固醇的量显著减少而胆固醇酯的变化不大的现象。 六、脂肪信号Adipsin-ASP系统1983年，Spiegelman用梯度凝胶电泳和Northern杂交技术检测培养的鼠3T3脂肪细胞和前脂肪细胞总mRNA水平时，发现脂肪细胞较前脂肪细胞多三条特异的mRNA带，其中adipsin mRNA是分化的脂肪细胞所特有的，尤其在鼠的白色和褐色脂肪组织adipsinmRNA水平分别下降75%和68%，在胰岛素缺失的实验模型中，adipsin mRNA水平增加2～3倍，而在遗传性肥胖实验模型中，脂肪组织adipsin mRNA水平降低96%～99%。 许多研究表明，adipsin是一种丝氨酸蛋白酶，由脂肪组织和坐骨神经产生，存在于循环血液中。 Rosen用酶分析认为adipsin具有补体因子D的活性，而抗体中和试验也强烈提示鼠adipsin是人补体因子D仅有的同系物，White采用氨基酸序列分析表明adipsin同丝氨酸蛋白酶家族中主要成员有30%同源性，而与人补体因子D有60%同源性，而且经重组的adipsin可能替代补体因子D激活补体旁路途径。 另外还发现，在肥胖型老鼠的血液中，补体因子D的活性也随着adipsin mRNA的水平下降而降低。 最近White对人adipsin mRNA的成功克隆最终证实了adipsin和补体因子D为同一种物质。 在脊椎动物，补体系统是主要免疫防御体系之一。 外来微生物的溶解是通过激活了抗体依赖性补体激活途径或抗体非依赖性补体激活途径来实现的，这两种激活途径都可形成裂解成孔复合体（lytic pore complex），破坏感染的细胞膜成分，导致细胞的裂解。 我们知道，大多数补体蛋白都是由肝细胞和免疫细胞合成的，而脂肪组织特异性蛋白酶adipsin是人补体因子D的同系物，说明补体旁路激活与脂肪细胞的生物学行为间存在某种联系，受这一结果的启发，Lisa终于取得令人满意的结果：脂肪细胞和脂肪组织，还可合成补体旁路激活途径中的另外两个关键补体因子C3和B，表明脂肪组织在局部的免疫防御反应中起有重要的作用。 SDSPAGE分析表明，补体因子B和D由一条多肽链组成，而C3由两条链组成，C3α（110kD）和C3β（70kD）之间由二硫键相连。 将因子C3、B和adipsin/D放在一起孵育发现，adipsin/D将因子B酶解为Ba和Bb，因子Bb与C3相连形成C3转化酶，将C3裂解为C3α（110kD）和C3α（9kD）。 过敏毒素C3α可能改变血管的通透性和收缩性，是一种趋化性细胞因子，能诱导单核细胞释放IL-1，Ba和Bb，调节淋巴细胞的生长，Bb还诱导人单核细胞的扩展，抑制单核细胞的迁移。 ASP是一个更具潜力的脂肪酸酰化剌激因子，他诱导TG合成具有双重效应：其一，ASP诱导葡萄糖经细胞器运输到细胞表面，使细胞膜对葡萄糖特异性转运增加，尽管细胞膜对脂肪酸的转运是由ASP间接引起的，但细胞对脂肪酸净吸收量的增加激活了甘油三酯合成的限速酶-甘油二酯酰基转移酶：其二，ASP实际上是补体C3的一个片段，命名为C3αdesArg，他具有调节细胞内甘油三酯合成的功能。 1993年，Baldo对ASP进行了氨基酸组成、分子量和N-端氨基酸序列分析发现，ASP和C3α的氨基酸组成非常接近，只是C3α比ASP多一个精氨酸，且N-端氨基酸序列均为N-Ser-Val-Gln-Leu-Thr-Glu-Lys-Arg-Met-ASP，离子喷射电离技术也证实ASP的质量单位（8933±0. 3）与C3αdesArg（8932. 5）一致，而不同于C3α（9088. 7）. 在血浆羧肽酶的作用下，C3α羧基未端Arg很容易被水解掉而形成C3αdesArg，尽管C3αdesArg曾被认为是C3的非活性产物，只有过敏毒素的作用，然而目前的资料已显示C3αdesArg确实能够促进细胞甘油三酯的合成。 已经明确，ASP能剌激成纤维细胞、脂肪细胞和HepG2细胞合成TG，且对分化的脂肪细胞影响最大，胆仍没有证据表明ASP对脂质水解有何影响，因为HyperApoB细胞TG的含量下降是由于该细胞对ASP的反应性下降而非细胞内TG的水解增加所致。 但Cianflone在分子水平利用RT-PCR技术检测了甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAP）、脂蛋白脂肪酶、adipsin、因子C3和因子b mRNA水平与ASP（C3α-desArg）之间的关系后发现，成纤维细胞和未分化的前脂肪细胞只能合成微量ASP，而分化的脂肪细胞在相同时间内产生大量ASP（是前者的8倍）；成纤维细胞和分化的脂肪细胞内GAp mRNA水平无差异，而LDL mRNA在分化的脂肪细胞内明显增加，其意义有待进一步探索。 另外，分化的脂肪细胞内因子C3和adipsin mRNA水平异常升高，因子B mRNA水平只略有升高，这些变化与ASP（C3α-desArg）大量增加平行。 因此，adipsin/D-ASP/C3α-desArg系统可能具有非常重要的生理意义。 当脂肪组织对脂肪酸的摄取能力下降时，大量脂肪酸滞留于血浆中，LPL的活性则受到严重抑制，不能有效水解血浆中的TG，而Adipisn-ASP系统可以上调脂肪组织对血浆游离脂肪酸的吸收率，使血浆中游离脂肪酸的水平不致于上升到有害的程度，LPL也能充分发挥其有效的生物活性，水解血浆中的TG和富含TG的脂蛋白，有效地调节甘油三酯的水解和合成。 七、HyperApoB的病理生理HyperApoB是Sniderman分析了大量临床资料后于1980年首先提出的，该患者脂代谢紊乱的主要表现是血ApoB和LDL水平升高，LDL-C同LDL-ApoB之比明显降低。 据Montreal心脏研究中心对100例HyperApoB合并冠状动脉粥样硬化患者实施主动脉-冠状动脉搭桥术后，十年随访结果显示：血清LDL-ApoB水平升高和HDL-ch水平降低是冠状动脉粥样硬化病变进展的两个最有价值的指标，不管是发生在原位冠状血管，还是在隐静脉旁路移植块。 Brown等对血清LDL≥72. 5μmol/L、有冠状动脉搭桥术史和早发冠心病的遗传背景的患者采用控制饮食和降低脂质相结合的治疗方案。 结果表明：当血清LDL-ApoB的浓度下降时，冠状动脉内的粥样斑块也随之消退。 正常人的LDL是一类非均质的大分子物质，密度为1. 019～1. 063kg/L,HyperApoB患者LDL的分子量小于2. 0×106D，直径仅有23nm,Sf值也小于5. 0，而密度则高达1. 055kg/L，该患者LDL组成分析表明，胆固醇酯的含量明显降低，ApoB含量明显升高，而甘油三酯、磷脂和非酯化胆固醇含量基本不变。 另外，HyperApoB患者往往合并血清Lp（α）水平升高，而PROCAM研究中心则认为血清Lp（α）水平与ApoB或ApoA-Ⅰ的浓度变化无关。 大量研究显示HyperApoB患者体内LDL受体活性是正常的，并认为LDL-ApoB的增加是大量VLDL-ApoB的继发性改变。 于是，许多实验室开始研究HyperApoB患者ApoB的分子或基因变异情况，Gavish应用ApoB的单克隆抗体封闭ApoB的某种抗原点位，发现LDL-ApoB的浓度。 但大规模遗传连锁分析还没有确认HyperApoB患者同ApoB基因所在染色单体之间的关系，而且Johns Hopkins冠心病研究小组也没有发现ApoB的影响变异与HyperApoB之间存在某种密切关系。 从目前资料来看，ApoB的基因变异或缺失似乎对HyperApoB的影响甚微，无法解释HyperApoB的各种表型。 已发现HyperApoB每一种表型都存在于两种代谢障碍。 其一，肝组织大量合成VLDL，致使致密的LDL水平升高，Teng用ApoB的单克隆抗体分别封闭致密和疏松的LDL微粒，发现致密的LDL与LDL之间向乎无反应，而疏松的LDL微粒与LDL受体之间的高亲和力下降，致使LDL表面的ApoB重新分布。 来自动物体内和体外的实验结果也证实疏松的LDL很容易从血液循环中清除，而致密LDL常需要很长时间。 Kwiterovich认为致密LDL可能通过清道夫受体途径从血液中清除，这种代谢方式将促成动脉粥样硬化的形成和胆固醇酯在血管壁的沉积，但研究结果出乎意料，来源于HyperApoB患者体内的LDL并不能促进正常人或HyperApoB患者单核源性巨噬细胞大量合成胆固醇酯。 而且Knight等也没有发现单核源性巨噬细胞优先吸收和降解HyperApoB患者的致密LDL。 其二，从饮食中摄入的脂肪经乳糜途径延迟，血中游离脂肪酸的浓度明显升高。 Sniderman等的研究表明脂肪细胞和成纤维细胞摄取游离脂肪酸合成甘油三酯的能力下降，可能是血中游离脂肪酸水平升高的主要原因，而游离脂肪酸则诱导肝细胞合成和分泌装配VLDL的载脂蛋白B。 由于血清碱性蛋白与脂代谢密切相关，而HyperApoB的发病机制又无法从ApoB的基因变异、LDL受体和清道夫受体水平上找到合理的解释，许多实验室已将目光转入血清碱性蛋白质的研究上，并试图解开HyperApoB的发病机制。 尽管目前的研究水平仍停留在对碱性蛋白质结构和功能的探讨上，但Kwiterovich已根据现有的研究成果，对HyperApoB的生化特征从碱性蛋白质及其受体的角度作出了大胆的假设，如图7-3所示。 图7-3 HyperApoB病理假说图解综上所述，三种血清碱性蛋白质所具有酰化剌激活性确实为我们进一步认识血浆脂质、脂蛋白和游离脂肪酸的代谢及HyperApoB的致病机制提供了新的视野，但其确切的生化机制有待进一步阐明。 血清碱性蛋白质与补体系统之间的关系。 以及碱性蛋白的组织特异性仍将是今后研究的重点。 第三节　LDL受体相关蛋白LDL受体相关蛋白质（LDL receptor related protein ,LRP）是Herz等于1988年发现，其组成及结构与LDL受体类同，可能属于残粒受体（remnant receptor）的一种。 其后证明，LRP又是α2-巨球蛋白（α2-macroglobulin,α2MG）受体。 根据LRP的cDNA分析，他含有与LDL受体相同重复序列，而且与LDL受体重复序列互补的寡核苷酸可与LRP交叉杂交，所以称为LDL受体相关蛋白。 LRP组成及结构见图7-4所示。 一、LRP组成及合成部位利用寡核苷酸筛查法，已得到LRp cDNA并已阐明LRP氨基酸排列顺序，如图7-6所示。 LRP由4526个氨基酸残基组成，是一种大分子量的糖蛋白，分布于大多数细胞内膜。 LRP与LDL受体，二者的配体结合结构极为相似，并与补体C8/C9结构组成具有高度类同性。 图7-4 LRP的结构与LDL受体结构比较图7-5 LDL受体蛋白（LRP）的结构与代谢图7-6 LRP的氨基酸序列（引自HerzJ. 1988）细胞膜外存在的ECG前体结构域，LRP与LDL受体也类同，其中细胞外部的结构同样以三种形式存在：①20个氨基酸中有6个半胱氨酸残基，这种A基元（Amotif）带负电荷，该结构与脂蛋白结合有关；②EGF前体结构域的B基元的40个氨基酸中也有6个半胱氨酸存在，起有间隔基元的作用；③EGF前体结构域的另50个氨基酸序列中有Tyr-Trp-Thr-Asp结构，即YWTD重复序列。 这一系列的相同性可能与这两种基因结构类似性有关。 LRP有两个疏水性很强的结构存在，其一是N端19个氨基酸的信号肽；其二是C端侧的组抽酸残基。 跨膜结构域N端存在多个半胱氨酸，在细胞膜外侧以-S-S-键连接。 LRP比LDL受体大两倍。 LDL受体的有被小窝（coated pit）的第807位为酪氨酸，其周围的氨基酸组成与LRP高度相似。 经有被小窝包吞作用（endocytosis）摄取细胞外物质的过程，LRP与其完全相同。 在LDL受体胞液结构域的氨基酸序列中天冬酰胺-脯氨酸-X-酪氨酸（NPXY）重复序列存在，在LRP结构中也存在。 LRP在细胞粗面内质网合成，分子量为600kD（SDS-PAGE检测），在高尔基氏体内分解成515kD和85kD两种分子形式，分别称为α、β亚基，二者以非共价键结合。 515kD的α亚基以贯通形式存在于细胞膜上，85kD的β亚基存在于膜内（见图7-5）。 二、LRP功能直到目前为止，LRP的功能尚未完全清楚。 LRP具有脂蛋白受体的以下特性：①摄取含ApoE的β-VLDL，摄取量与脂蛋白中ApoE含量有关；②ApoE存在时，LRP作用可促进脂蛋白的摄取；③LRP机能不受细胞内胆固醇水平的调节；④抑制含ApoC群的脂蛋白摄取，从而阻碍脂蛋白摄取。 细胞内胆固醇含量不受下调作用的影响，是动脉粥样硬化灶中泡沫细胞生成的重要条件。 LRP是信赖于Ca++的蛋白质，与配体结合需要Ca++的存在。 有报道，LRP可结合含ApoE的脂蛋白，并协同LPL的催化作用。 LDL受体缺乏者，LRP起有重要作用。 Kowdl和Beisiegel等报道，乳糜微粒残粒和β-VLDL均可被LRP识别；β-VLDL既可与LDL受体结合，又可与LRP结合；α2M也可作为配体与LRP结合，β-VLDL可抑制对α2M的摄取，以促进细胞内胆固醇酯的形成。 α2M可与丝氨酸蛋白酶等多种蛋白质分解酶结合成复合物，并可经巨噬细胞膜上的α2M受体识别而进入细胞内，LRP则可抑制这种结合作用。 LRP还可以抑制α2M与TGF-β、b-FGF、IL-Iβ和IL-b等细胞因子的结合作用。 据此推测。 分子结构与α2M受体蛋白为同一物质。 利用精制的鼠肝细胞膜部分实验观察到，利用LDL受体缺乏的成纤维细胞实验，β-VLDL可竞争性抑制对α2M的摄取，α2M又可抑制乳糜微粒残粒的摄取。 实验表明，LRP可能既是乳糜粒残粒受体，又是α2M受体之一。 经单克隆抗体免疫学实验检测，LRP蛋白质的mRNA在肝脏、肺、脑、小肠和肌肉等组织存在，与LDL受体比较，肝脏的LRp mRNA的量约有10倍之多。 通过聚合酶链反应（PCR）和免疫组织化学检查发现，在动脉粥样硬化巢病变组织里，LRP含量迅速增加，并发现内膜的粥样硬化巢里由平滑肌细胞、巨噬细胞转变的泡沫化细胞中同样也有LRP的存在。 第四节　微粒体甘油三酯转移蛋白WetterauJ. R等于1984年发现肝细胞微粒体的离子强度缓冲液里有加速甘油三酯和胆固醇酯转运作用，用Bio-Gel A-5m和Hydroxylapatite纯化，并监测其活性，发现该蛋白的激活作用促进甘油三酯转运的活力大。 经凝胶过滤测得分子量约为150kD，部分纯化产品等电点为pH5. 2～5. 6，该蛋白即为微粒体甘油三酯转移蛋白（microsmal triglyceridetransfer protein, MTTP）。 一、MTP蛋白质结构及特性1991年，Wetteran J R等发现MTR由58kD和88kD的两种亚基组成的异二聚体复合物。 这一特点使之与以前报道的脂质转运蛋白加以区别，以前报道的脂质转运蛋白是单一多肽，分子量从8kD到53kD不等，发现几种哺乳动物包括人的血浆中的胆固醇酯转运蛋白（CETP），均属于糖蛋白，分子量为74kD，含一个53kD的多肽骨架。 MTP的58kD的小亚基通过氨基酸分析和免疫化学分析表明他是蛋白二硫键异构酶（protein disulfide isomerase,PDI；EC5. 3. 4. 1）早在1963年就在肝和胰腺组织中发现此酶，其功能之一是催化蛋白质生物合成中的二硫键形成，具有较宽的底物特异性。 PDI在新鲜制备的鼠肝微粒体中未能检测其活性，但破膜后，可检测到二硫键异构酶活性。 PDI是一种多功能蛋白，据报道他又是脯氨酰-4-羟化酶（prolyl 4-hydroxylase）的β亚单位；还与寡糖基转移酶的糖化位点结合蛋白亚组分高度相似。 PDI羧基端序列Lys-Asp-Glu-Leu与内质网上相应受体结合，使之与88kD组分一起保留在内质网腔内，PDI基因定位在17号染色体。 据估计，牛肝内质网腔中游离PDI浓度超过MTP中PDI浓度的五倍。 此，PDI自我组装成二聚体和四聚体。 MTP中PDI的二硫键异构酶活性仅是自由PDI的十分之一。 用沉降平衡实验表明，这种150kD的MTP有三种不同的沉降速率。 他们分别是MTP、PDI和一个88kD的亚基。 进一步用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色测定一定量MTP中PDI含量，与标准PDI比较，表明PDI：88kD亚基之比为1：0. 98～1. 30，证明MTP中58kD的PDI和88kD亚基化学计量为1：1。 通过超速离心发现沉降系数为5. 85,Stoke半径为4. 7μm。 用盐酸胍变性实验表明，MTP可抵抗0. 8M盐酸胍的变性作用，PDI与88kD亚基结合稳定。 PDI与MTP大亚基作用不可逆，到目前为止，试图用其组分或外源PDI重建MTP复合体还未功能。 通过远紫外圆二色光谱分析表明，MTP约有28%α螺旋和随机结构（分别为31%和34%），而88kD亚基的β折叠占35%。 MTP的大亚基与已发现的蛋白相比未发现高度同源性。 Shoulders等从MTP辨认出几个区域与卵黄磷脂蛋白的序列有低水平同源性。 卵黄磷脂蛋白是产卵动物中脂蛋白复合体的蛋白质组分，由卵黄生成素裂解而成。 基于氨基酸序列、分子模型和基因结构的比较，认为MTP大亚单位是卵黄生成素基因家族成员之一。 二、MTP基因结构1993年Sharp D. 等克隆MTP 88kD大亚基的cDNA并进行序列分析，比较人和牛的cDNA表明有88%核苷酸序列相同，在人MTP大亚基的3末端有基因组DNA编码的18个腺苷酸残基，预测的分子量97kDa，人和牛MTP大亚基单位氨基酸有86%同源性，加上保守性氨基酸替换，人与牛MTP大亚基单位有94%同源性。 在核苷酸和蛋白序列数据库中未发现其他蛋白与之同源。 SharpD. 等MTP88kD大亚基基因结构进行分析（图7-7）。 其基因跨越55～60Kb，由18个外显子组成，外显子1和18也分别包括5和3的非编码序列。 除掉含非编码序列的外显子1和18，平均每个编码外显子的长度是153bp。 图7-7 人MTP大亚基的基因结构上线表明基因跨度；第二线为MTP大亚基的18个外显子示意图；第三四线分别是EcoRI（R）和Hind（H）的酶切位点。 SharpD等早期报道，人MTp cDNA 5端非编码区有64个核苷酸。 用锚定PCR检测MTpcDNA的5末端，从两个独立PCR产物的直接序列分析揭示，从翻译起始的上游有86bp的非编码序列（见图7-8）。 所有86bp5端非翻译区均编码外显子1，外显子1还有61bp编码信号肽及成熟蛋白2个氨基酸。 在翻译起始框外上游25bp有一个ATG，但该处没有适合的起始环境，第二个ATG是真正的翻译起始点。 图7-8 MTP大亚基的5侧翼序列转录起始点5侧翼序列不含TATA盒，但富含AT序列，在转录起始点上游约30bp的AAAGATAAA可能被TATA结合蛋白（TFⅡD）识别。 用Nothern blot杂交及分析MTP活性表明MTP在肝和肠表达，在卵巢、睾丸和肾也发现有低水平MTp mRNA表达。 计算机辅助分析转录起始点上游743bp序列表明，他与几种已知顺式作用元件同源，可调节MTP组织特性性表达。 在转录起始点第一个200bp序列含肝特异C/EBP、HNF-1和HNF-5转录因子识别的上游启动子元件，该区还含有通用转录因子Sp-1和Ap-1识别序列。 Sp-1，C/EBP、HNF-1和HNF-5在该区的位点有单个碱基错配。 其他比第一个200bp更上游的顺式元件可被HNF-5，C/EBP和CTF/NF-1识别。 MTP大亚基限制性片段长度多态性分析或简单序列的串联重复多态性分析，均可用于调查MTP基因与异常血浆脂类或脂蛋白代谢的联系。 CA双核苷酸重复多态性在人基因组随处可见，这种重复可用PCR分析，因而是一种理想的基因标记。 为了识别CA双核苷酸重复序列，用一个CA重复的探针来与MTP大亚基因进行杂交，在内含子10发现非完整CA重复结构(CA)4AA(CA)3GA(CA)4TA(CA)nTACA,分析18个不相关个体的36个等位基因表明有8种变异，n从8到17。 荧光原位杂交表明MTP大亚基基因位于4号染色体，即4q28-q31。 三、MTP生理功能和基因突变脂质转运蛋白促进膜间不溶性脂类分子转运，MTP的特性在于他剌激膜间中性脂类（甘油三酯、胆固醇酯、磷脂酰胆碱）转运。 脂质转运蛋白也能促进膜间脂质分子交换或促进从一种膜向另一种膜净转运脂质分子，虽然有例外，但在体外分析表明脂质转运蛋白一般是促进膜间脂质分子交换。 当供体和受体膜间TG浓度相等时，MTP能促进膜间交换TG，而且当供体和受体膜间中性脂类浓度不平衡，中性脂类仍可转移到受体颗粒，表明MTP能净转运TG和CE。 MTP存在于肝细胞和小肠细胞微粒体腔内，在富含甘油三酯的脂蛋白的正常组装、分泌中起有重要作用。 用MTP抑制剂研究表明，MTP在含ApoB48脂蛋白组装的早期而不是晚期起作用，光亲和MTP抑制剂能阻断McArdle RH-7777细胞分泌含ApoB的脂蛋白，当这种细胞在缺乏MTP抑制剂和油酸时，贫脂质（HDL）的ApoB48颗粒可以形成，但不能分泌。 油酸加入这种培养细胞后可转化成能分泌的富脂质的颗粒。 然而，如果在贫脂复合体形成之后加入MTP光亲和抑制剂，则对这种转化或分泌过程没有作用。 1992年Wetterau J. R等报道无β脂蛋白血症患者MTP活性和MTP蛋白缺陷。 SharpD. 等1993年从一个无β脂蛋白血症患者取小肠活检，该患者是近亲婚配的女性后代，39岁，用RT-PCR结合序列分析表明215位胞嘧啶缺失，导致发生移码突变，移码突变导致在下游21个碱基处过早形成一个终止密码，并预测翻译产物为78个氨基酸。 进一步分析发现该患者是移码突变的纯合子。 从一个14岁女性无β脂蛋白血症患者发现1783位C→T转换，这个突变使Arg密码变成终止密码，产生594个氨基酸的截短产物。 这个无义突变消除了一个TaqⅠ限制性内切酶位点。 Southern杂交分析表明该患者为纯合子，而其父母都是含正常和突变的杂合子。 为检测这些突变对MTP的影响，将PDI和野生或突变MTP大亚基用杆状病毒表达系统在sfq昆虫细胞共同表达。 用表达PDI和野生MTP大亚基病毒共传染sfp细胞，可产生有活性的MTP。 相反，用表达PDI和突变MTP大亚基病毒共传染sfq细胞，则不能产生有活性蛋白，突变蛋白也形成不容性凝聚体，不能与PDI结合。 该结论可用解释无β脂蛋白血症患者的突变后MTP活性和MTP蛋白的缺陷。 到目前为止，MTP大亚基的突变有码突变、无义突变及点突变改变了MTP的正常剪接。 第五节　胆固醇调节组件结合蛋白胆固醇调节组件结合蛋白（SREBPs），是一类能与胆固醇调节组件1（SRE-1）发生特异性结合的“碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链”（bHLH-ZZP）蛋白。 在细胞内缺乏胆固醇的情况下，SREBPs通过和SRE-1的结合，激活SRE-1的基因，使其翻译增强，发挥生理功能。 一、胆固醇调节组件1的功能和定位编码低密度脂蛋白受体（LDL-R）的基因5侧翼区，具有一个长10个碱基对的胆固醇调节组件1（sterol regulatory element 1,SRE-1）。 SRE-1是一个条件正性调节组件，仅在细胞内胆固醇缺乏的条件下，才被激活。 在其他的胆固醇调节基因如羟甲基戊二酸单酰CoA合酶（HMGCoa synthase ）基因的启动子中也含有SRE-1，而在羟甲基戊二酸单酰CoA还原酶（HMGCoa reductase ）基因的启动子中含有类似于SRE-1的胆固醇调节组件（SRE）。 SRE-1通过调节LDL-R基因、HMGCoA合酶基因的翻译，控制细胞对外源性胆固醇的摄取量和内源性胆固醇的合成速率，调节细胞内胆固醇含量。 SRE-1在LDL-R基因5侧翼区的定位见图7-9。 图7-9　+1表示翻译起始位点，T/A表示TATA盒，空心箭头表示重复区，重复区1、重复区3可能和Sp1（一种正性翻译因子）结合。 重复区2内含有SRE-1。 二、SREBPs的发现和命名1989年，Tripathi B. Rajavashisth发现了一种能和SRE结合的锌脂蛋白。 1993年，MichaelR. Briggs等人，利用离子交换层析、凝胶过滤和DNA亲和层析的方法，从人类宫颈癌细胞（Hela细胞）核的提取物中分离出了这一组能与SRE-1结合的蛋白质，并将其命名为胆固醇调节组件结合蛋白（sterol regulatory element-binding proteins, SREBPs）。 SREBPs在细胞胆固醇缺乏的情况下，通过和SRE-1的结合，激活LDLR基因、HMGCoA合酶基因的翻译。 三、SREBPs的结构和分类SREBPs具有“碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链”（basic helix-loop-helix-leucine zipper, bHLH-ZIP）结构，是bHLH-ZIP蛋白系列的一种。 bHLH-ZIP蛋白包含一系列能特异性地和含E盒（e box, CANNTG）的DNA结合的蛋白质，例如：调节免疫球蛋白基因翻译的TFE3，致肿瘤蛋白Myc等。 SREBPs虽是bHLH-ZIP蛋白中的一种，但又不同于其他的bHLH-ZIP蛋白。 一方面，SREBPs分子量大，含1140个左右的氨基酸残基；另一方面，SREBPs不识别E盒（e box）而特定地识别SRE-1中直接重复的“CAC”序列。 迄今为止，发现有两种SREBPs。 一种称SREBP-1，另一种称SREBP-2。 SREBP-1又由于其mRNA剪接方式的不同，以三种功能上完全相同，组成上略有不同的形式大量存在，这三种形式的蛋白分别称为SREBP-1a、SREBP-1b、SREBP-1c。 其中，SREBP-1a是SREBP-1的主要存在形式，故本文以SREBP-1a为例来描述SREBP-1。 SREBP-1a含1147个氨基酸残基。 分子量为125kD。 至今，还没有发现SREBP-2存在多种不同的剪接后蛋白。 SREBP-2含1141个氨基酸残基，分子量为121kD，与SREBP-1a之间有47%的同源性，含高度保守的bHLH-ZIP区，和SREBP-1a的bHLH-ZIP区有71%的一致性。 但是SREBP-2含有不同SREBP-1a的谷氨酸富集区（在121个氨基酸残基中含多于27%的谷氨酸残基。 SREBP-1a和SREBP-2的氨基酸序列和功能域结构之间的比较参见图7-10（A、B、C）。 图7-10 A：SREBP-2和SREBP-1a氨基酸序列之间的比较“--”表示二者的相同部分图7-10 B：SREBP-2和SREBP-1a的bHLH区（粗横线所示）的比较四、SREBPs的生理功能两种SREBPs利用位于其氨基酸残基470～570之间的疏水序列，附着于内质网膜和核膜，在氨基端的470个氨基酸残基组成的肽链中，均含“碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链”的核心结构，使蛋白质能形成均一二聚体，并能和SRE-1结合。 两种蛋白质氨基端一侧的结构中，都有酸性区域，可能作为DNA翻译的增强子。 当人或仓鼠细胞在缺乏胆固醇的环境中培养时，蛋白酶在亮氨酸拉链和膜间的附着区处裂解SREBPs，并从膜上释放出水溶性的氨基端的裂解片段，这一片段约含470个氨基酸残基，表现分子量为68kD。 这一片段能够移行入胞核，结合于SRE-1，从而激活LDLR基因翻译和HMGCoA合酶基因翻译。 SREBPs裂解、移行入胞核，进而结合于SRE-1，以致激活LDLR基因、HMGCoA合酶基因，都有赖于细胞内缺乏胆固醇。 因为胆固醇能够抑制SREBPs的裂解。 而已形成的SREBPs的裂解片段又很容易被迅速分解，从细胞核中快速消失。 故而胆固醇的存在，将阻断整个调节通路，使SRE-1失活。 将SREBP-1和SREBP-2进行cDNAg隆，并采用质粒转染动物细胞的方法，使培养细胞，如Hela细胞和中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞），表达SREBP-1和SREBP-2，发现他们调节细胞内胆固醇代谢的过程是一致的，功能上是协同的，然而两种蛋白质是单独发生作用，没有发现杂化二聚体。 为什么存在这两种组成不同但功能一致的SREBPs，原因还不清楚。 研究仓鼠肝脏中产生的，由细胞内胆固醇含量调节的mRNA（包括LDLR和HMGCoA合酶的mRNA）的含量。 肝脏经HMGCoA还原酶抑制物mevinolin处理后，这两种mRNA的量都增加。 通过阻止胆固醇的合成，mevinolin诱导暂时的胆固醇水平降低，而增强胆固醇调节基因的翻译。 当mevinolin和胆汁酸结合树酯，如降胆灵合用时，mevinolin增强翻译的效果更强。 降胆宁通过阻止肠道对胆汁酸的再吸收，使胆固醇转变为胆汁酸，因而增加肝脏对胆固醇的进一步需求。 最近，研究HMGCoA还原酶抑制物和胆汁酸结合树酯是否促进SREBP-1和SREBP-2在仓鼠肝脏中的蛋白裂解，与在培养的细胞中的发现有些不同。 资料表明SREBP-1和SREBP-2的裂解片段在仓鼠肝脏中的调节作用是不一致的。 仓鼠肝脏经mevinolin 加降胆宁处理后，SREBP-2的裂解片段增多，而SREBP-1的裂解片段减少。 这一结果似乎表明在仓鼠肝脏中，SREBP-1对LDLR和HMGCoA合酶基因的基础翻译起作用，而SREBP-2对经胆汁酸结合树酯和胆固醇还原酶抑制物处理后，形成的胆固醇缺乏状态的基因翻译起作用。 另有报道，胰岛素和类胰岛素生长因子Ⅰ也可以通过SREBP-1介导LDL-R启动子的激活，从而调节细胞内的胆固醇含量。 总之，在细胞内胆固醇含量的自我平衡中，SREBPs起了重要作用，其详细机制的阐明，必然对胆固醇代谢调节的研究产生重大影响。 （董学梅 滕思勇 郑芳 崔天盆）（脂类代谢有关的特殊蛋白质）参考文献1. 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